骨质疏松症发病相关长链非编码RNA的研究进展

李晓宇 费琦 林吉生 于凌佳 杨雍 李东 李锦军 孟海

首都医科大学附属北京友谊医院骨科，北京 100050

原发性骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种常见的全身性骨骼疾病，导致骨骼脆性改变和骨折风险增加。随着我国老龄化社会的到来，原发性骨质疏松症已成为面临的重要健康问题。骨质疏松症是一种复杂的疾病，受环境因素和遗传因素影响[1]。OP的易感性由多种遗传变异及其与饮食运动等环境因素之间的相互作用而决定。骨质疏松的遗传率估计为50%～85%，提示遗传因素在OP发病中的重要性[2]。鉴定OP相关基因，并明确其致病机制，对于OP的预防和治疗意义重大。长链非编码RNA(long non-coding，lncRNA)是近年来研究的热点，它是一种长度大于200个核苷酸的无或很少编码蛋白质的RNA，虽然一段时间人们认为lncRNA只是转录中的副产物，不具有生物学作用。但是近年来，很多的研究证实lncRNA具有复杂的生物学功能，与人类疾病的发生有密切的联系。lncRNA可以在转录、转录后和表观遗传学水平上调节靶基因，参与包括骨质疏松症在内的疾病的发生[1-2]。自从Morrison于1992年发现维生素D受体基因型与骨密度关系密切以来，目前已经发现近100种骨质疏松相关基因，主要包括以下4个方面：(1)钙离子相关激素及受体；(2)成骨细胞；(3)破骨细胞；(4)其他方面。骨质疏松相关的基因研究是目前研究的热点与难点，其发病的分子机制了解还十分有限，这已成为骨质疏松症的临床治疗与基础研究的瓶颈。基因调控位点的发现及其对骨密度变异的生物学功能的阐明，对于了解骨质疏松症的病因，开发新的骨质疏松症筛查、预防和治疗方法具有重要意义。本文就lncRNA在骨质疏松方面的研究进展展开综述，探讨其研究现状及发展前景。

1 LncRNA与骨质疏松

大约70%的人类基因组能够被转录，而其中仅有1%～2%能够编码蛋白，余下98%均为非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)。ncRNA在很长一段时间里都被认为转录的副产物。直到1990年，Richard Jorgensen在对牵牛花做基因改造时发现添加的DNA序列会影响内源性基因的表达，RNA干扰(RNAi)的首次发现才引起研究者对ncRNA功能的关注。根据核苷酸序列的长度，ncRNA可分为短链ncRNA(short/small ncRNA)和长链lncRNA(long ncRNA)，一般将长度大于200核苷酸ncRNA定义为lncRNA。lncRNA虽然不编码蛋白质，但通过反式和顺式两种方式在调控基因转录中发挥重要作用[3]，可以在转录、转录后和表观遗传学水平上调节靶基因，与包括癌症和骨质疏松症在内的疾病有关[4]。lncRNA在细胞核内和胞质中可以通过各种机制调节基因的表达，在细胞核内主要通过参与表观遗传调控、参与转录水平调控、对胞核核体结构进行调节[5-7]。lncRNA可以在转录、转录后和表观遗传学水平上调节目标基因，目前发现其与mRNA、miRNA、蛋白均存在互作机制，包括OP在内的多种疾病中都有lncRNA调控涉及，有望成为疾病诊断与预测的生物学指标[4]。人体的骨代谢是维持一种“骨生成与骨凋亡”的平衡状态，维持这种平衡需要一系列信号通路共同参与调控，包括cAMP、CaMK、MEG3、DEPTOR、MAPK等[8-9]，lncRNA在这个过程中扮演了重要的角色。

lncRNA是骨质疏松症病理生理过程的重要调控因子，现有的研究已经证实骨质疏松和骨密度具有遗传性，已有超过60个易感位点被发现与骨质疏松和BMD有关[10-11]。已发现lncRNA-H19、TIST和MEG3均被发现涉及骨质疏松相关的成骨细胞分化，凋亡过程[12-14]。Fei 等[15]通过高通量RNA测序鉴定了绝经后骨质疏松症患者和正常对照患者血液样本的lncRNA和mRNA表达，共获得185个显著的差异表达mRNAs和51个显著的差异表达lncRNA。这也是首次通过RNA测序得到绝经后骨质疏松的lncRNA表达，并构建出了差异表达的mRNA与差异表达的lncRNA共表达网络。Jin等[16]研究了骨质疏松患者外周血淋巴细胞中的LncRNA表达，共发现了70个显著表达的LncRNA，其中上调LncRNA39个，下调LncRNA 31个。陈娟等[17]对比了绝经后骨质疏松症6例和健康绝经后妇女3例的lncRNA表达水平，发现了8条lncRNAs 可能通过调控 Jak/STAT、MAPK、胰岛素通路和钙离子代谢等信号通路参与绝经后骨质疏松症的发生发展过程。Zhang等[18]采用人全转录组芯片对骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的差异编码和非编码转录表达谱及功能网络分析进行了研究，在成骨分化过程中，共检测到1 408个差异表达的LncRNA，其中785个显著上调，623个显著下调。Zuo等[19]发现在间充质干细胞早期成骨分化过程中，LncRNA表达不同，实验组和对照组之间存在116个差异表达的lncRNA，提示了LncRNA可能在成骨细胞分化中发挥某些作用。目前的研究提示了lncRNA可能参与调解骨质疏松的发病过程，但是多数的研究只停留在转录组的初步筛选，并未涉及更加深入的研究，有待更加深入的考证。

2 LncRNA与钙离子

钙是人体内的重要物质元素，人体99%以上的钙离子分布于骨组织中，因此钙离子是研究骨质疏松不可或缺的一项重要因素。除构成骨以外，钙离子还可以通过激活多种细胞外信号通路参与骨形成，如环单磷酸腺苷(cAMP)、钙调蛋白激酶II(CaMK II)和多种钙离子依赖蛋白等。lncRNA可以通过调节与钙相关信号而参与骨代谢相关细胞的增殖、分化、运动、凋亡等各个生理病理过程。Mccoy等[20]在研究一种疫苗佐剂过程中发现，lncRNA A_30_P01018532与炎症免疫相关，上调其表达可以显著提高细胞内游离钙离子水平。Hadji等[21]观察到lncRNA H19在主动脉钙化患者中存在高表达，通过基因组分析，发现了lncRNA H19可以通过调节Notch1启动子的甲基化程度，下调2个下游基因表达Runx2 和BMP2，从而诱导成骨表达。此外，lncRNA H19基因控制印迹基因网络(IGN)中胰岛素样生长因子2(IGF2)的表达，在胚胎发育和个体生长过程中有重要作用。Huang等[23]在研究鼻咽癌的发病诱因过程中发现lncRNA FOXD3被沉默后可以增加细胞的钙离子浓度。由于骨质疏松与钙离子水平密切相关，且目前有关lncRNA调解钙离子文献较少，细胞游离钙水平是否影响骨质疏松发病有待进一步研究。

3 LncRNA与成骨细胞

成骨细胞在骨形成过程中要经历成骨细胞增殖、细胞外基质成熟、细胞外基质矿化和成骨细胞凋亡4个阶段，而lncRNA在其中扮演了重要的角色。Pei等[23]在对小鼠LncRNA的研究中发现了lncRNA参与成骨细胞的分化过程，提示LncRNA在成骨细胞分化中扮演着重要的角色。Chen等[8]采用卵巢切除小鼠模型分别在体内和体外诱导成骨，探讨了DEPTOR(DEP domain containing mTOR interacting protein)与骨髓间充质干细胞成骨分化的关系并对其lncRNA和mRNA序列进行了研究。最终揭示了DEPTOR参与骨质疏松的发病，并且在骨质疏松骨中有较高的表达。Xu等[24]发现LncRNA HIF1α-AS1(hypoxia-inducible factor 1α-anti-sense 1)不仅可以调节血管平滑肌细胞增殖凋亡过程，还是成骨细胞分化过程的重要中介，可能有助于研发骨质疏松症的基因疗法。Gao等[25]发现LncRNA MALAT1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript-1)在人骨髓间充质干细胞中增加了成骨相关转录因子的表达，通过竞争性结合miR-143抑制miR-143的表达，从而导致成骨分化。但是，LncRNA MALAT1在人骨髓间充质干细胞分化和骨质疏松发病中的作用尚不清楚。Wang等[26]研究了lncRNA MEG3在绝经后骨质疏松中的功能，发现了绝经后骨质疏松患者的骨髓间充质干细胞中MEG3和miR-133a-3p的表达明显增加，而MEG3过表达逆转了成骨诱导下调miR-133a-3p的过程，同时SLC39A1表达显著下降，最终导致骨髓间充质干细胞诱导的PMOP成骨分化受到抑制，进而促进了骨质疏松的发生。Peng 等[27]通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的基因表达进行了测定，发现LncRNA NTF3-5可以通过下调miR-93-3p促进成骨分化和骨再生。Jin等[28]发现LncRNA MIAT的下调可以增强人脂肪源性干细胞(hASCs)的成骨分化，首次揭示了MIAT在hASCs成骨分化中的表达谱，为骨组织工程提供了实验依据。LncRNA-H19最初被认为是一种成骨促进剂，Huang等[29]发现LncRNA-H19在骨髓间充质干细胞成骨分化过程中，存在着明显的表达上调，可以促进体外成骨细胞的增殖，LncRNA-H19过表达诱导人骨髓间充质干细胞体外成骨分化，促进体内异位骨形成。Bu等[30]探讨了LncRNA TSIX/miR-30a-5p轴在颗粒诱导骨溶解中的作用，发现TSIX负调控miR-30a-5p的表达，而miR-30a-5p可调节成骨细胞在体内和体外的凋亡。Linc-ROR是一个2.6 kb的LncRNA，是多能干细胞重编程的关键调控因子，其上调与人骨髓间充质干细胞成骨分化有关，LncRNALincROR的下调可以阻断人骨髓源性间充质干细胞的成骨分化[31]。

通过对LncRNA在成骨分化中的作用机制研究，探究细胞分子信号通路，有望从基因角度调节细胞分化方向，提高成骨分化效率，对骨质疏松的治疗以及骨组织工程学的临床应用意义重大。

4 LncRNA与破骨细胞

破骨细胞来源于造血干细胞(hematopoietic stem cell，HSCs)中的单核巨噬细胞系分化而来，其主要功能为局部泌酸以及释放骨基质降解酶完成骨的吸收和降解从而维持骨稳态。在破骨细胞相关的研究中，尤其是LncRNA在破骨细胞分化、融合、功能的研究非常缺乏。随着LncRNA的研究不断深入，越来越多的学者也开始关注lncRNA在破骨细胞中的调节机制。窦策等[32]首次报道了破骨细胞形成过程中lncRNA、mRNA、circRNA以及miRNA的表达谱，为探索破骨细胞分化机制提供了借鉴。Tong等[33]通过qRT-PCR分析发现低BMD患者的骨单核细胞内LncRNA DANCR存在显著的上调，提示LncRNA DANCR可以诱导骨单核细胞中IL6和TNF-a的表达，影响破骨细胞骨重塑过程。LncRNA DANCR参与骨质疏松症的病理学，可能成为绝经后骨质疏松症的生物标志物。Lee等[34]通过对破骨细胞分化过程中LncRNA和mRNA的分期特异性表达进行了分析后发现，LncRNA-jak3可以通过促进破骨细胞因子Nfatc1(nuclear factor of activated T-cells 1)的表达，诱导成骨细胞分化，证实LncRNA-jak3通过jak3/Nfatc1/Ctsk轴在破骨细胞分化中起着关键的功能。Chuan等[35]通过qPCR验证后发现Lnc-AK077216在骨形成过程中存在高表达，可抑制NIP45表达，促进NFATc1的表达，而NFATc1是破骨细胞生成过程中的重要转录因子，进而调控破骨细胞的形成。

到目前为止，有关破骨细胞相关的lncRNA研究仍十分有限，缺乏其深入的研究。精确调控破骨细胞分化的各个阶段，对临床上治疗骨质疏松及破骨细胞相关疾病具有重要意义。

5 总结与展望

LncRNA日益被公认是具有众多生物功能的关键调控分子。自LncRNA在哺乳动物中首次被证实存在以来，LncRNA的研究成为了目前研究的热点，有关LncRNA的生物功能被不断的发现也取得了重大的进展。尽管骨质疏松与LncRNA的生物学相关性被不断报道，但是目前的研究还多局限于转录组的研究，有关骨质疏松发病的确切的机制仍未完全了解。随着科学的不断进步，未来的骨质疏松症的治疗方案将有望提升到基因水平，可能通过操纵LncRNA表达水平来调节成骨细胞和破骨细胞的生物学功能。目前有关骨质疏松相关的LncRNA研究还很有限，LncRNA的深入研究不仅有助于了解骨质疏松症的分子生物学机制、提供新的生物学标志物，也对疾病的诊断、治疗及预后提供新的方式和手段。