宏基因组学在特应性皮炎研究中的应用进展

何素玲 田歆 陈丽洁 李俊龙 王建琴 刘玉梅

广州医科大学皮肤病研究所广州市皮肤病防治所皮肤科510095

通信作者：王建琴，Email：jianqinwang@foxmail.com；刘玉梅，Email：1109180611@qq.com

特应性皮炎（atopic dermatitis，AD）是临床上一种常见的慢性、反复发作的炎症性皮肤疾病，以瘙痒和反复湿疹样病变为主要特点。AD 的发病可能与皮肤微生物群落生态失衡、表皮屏障破坏、全身免疫反应和炎症等各种病理生理机制有关［1］。皮肤作为人体与环境接触的界面，是一个多种微生物共存的复杂生态系统，而微生物群落与宿主之间的相互作用可以影响个体的健康状况。近年来研究表明，皮肤微生物群生态失衡可加重皮肤屏障破坏进而激活皮肤免疫系统，导致AD的发病风险显著提高［2］。本文综述宏基因组学在AD微生物研究及治疗领域中的应用进展。

一、宏基因组学

宏基因组学（metagenomic）又称微生物环境基因组学（microbial environmental genomics），指直接从天然环境中提取全部微生物基因的遗传组成和群落功能，对微生物群体进行系统分析，构建宏基因组文库。1998 年，Handelsman等［3］首次提出“宏基因组”的概念，其定义为环境中全部微小生物遗传物质的总和，包含了可培养的和尚不可培养的微生物的全部基因。2005 年，Chen 和Pachter［4］将宏基因组学定义为，用现代基因组学技术直接研究自然环境中微生物群落，而不需要对某一特定的菌株进行分离和实验室培养。宏基因组学技术不依赖传统的培养技术，它的出现为研究微生物群落多样性、种群结构、进化关系、功能活性及环境之间的相互协作关系等提供了新的方法，对微生物学的发展有重要的影响。

宏基因组学的发展与现代测序分析技术的进步息息相关。宏基因组学的研究步骤主要包括：尽可能地提取、纯化某一特定环境中所有微生物样品的基因组DNA；高通量测序分析；通过适宜的克隆载体和宿主构建宏基因组文库；筛选比对文库，寻找新的生物功能基因及活性物质。宏基因组测序技术的发展大致可分为3 个阶段，第一代测序技术是Sanger 法，这种测序方法准确率较高，但测序通量较低，较多适用于原核生物的16S rRNA的数据分析［5］。第二代测序技术是高通量测序技术，是目前应用最广泛的技术。高通量测序技术可以同时进行大量样本的测序，一次性产出大规模测序数据，具有快速、高通量及成本低的特点，因此被广泛应用于全基因组测序、宏转录组分析和基因组结构分析等工程。第三代测序技术为单分子测序技术，该技术通过单分子荧光测序及纳米孔测序直接检测DNA，不再需要经过PCR 扩增，减少了DNA 扩增过程中产生的错误，提高了测序读长，是未来测序方式前进的主要方向［6］。测序技术作为宏基因组学重要的研究手段，为宏基因组学的应用及实践提供了更多的机会。

二、宏基因组学在AD微生物研究中的应用

1.人体微生物组计划：宏基因组研究在人类医疗诊断、生物技术、生物能源、环境修复、农业和环境生态等各方面取得了丰硕的成果，对于微生物的物种和多样性组成、生态功能、进化演替、相互作用等也有新的突破。为了探索微生物群落变化与人类疾病健康之间的关系，2007 年12 月，美国国立卫生研究院正式启动人体微生物组计划，采集来自人体5 个不同部位（皮肤、口腔、鼻腔、胃肠道和女性生殖道）的微生物群落进行研究，计划完成900个人体微生物基因组测序［7］。研究发现，人体微生物与人体健康息息相关，如肠道微生物对人体消化吸收、营养代谢、维持肠道功能和免疫系统的发展具有非常重要的作用［8］。在皮肤疾病方面，微生物失调可能引起皮肤慢性炎症性疾病，如AD、银屑病、酒渣鼻等［9］。

2. 皮肤屏障与AD：不同部位的皮肤表面具有不同的pH、温度、水分、皮脂含量和局部解剖结构特点，根据不同的生理特点，可将皮肤部位分为干性、油性和湿性部位。常见的干性部位有手掌、掌前臂和前臂等，油性部位有前额、外耳道和后背部等，湿性部位有鼻孔、腋窝、腘窝和腹股沟等。皮肤屏障在防止过敏原和微生物渗入人体中起着至关重要的作用［10］。AD 患者的病变和非病变部位皮肤都可观察到一些表皮屏障的变化，如pH值升高、保湿功能降低、易致敏、对低分子量的物质渗透性增加以及对感染的易感性增加［1］。皮肤屏障处于皮肤结构的最外层，由终末分化的角质形成细胞组成，其组成成分包括角蛋白、聚丝蛋白（filaggrin，FLG）以及含有脂质、结构蛋白和丝氨酸蛋白酶的细胞外基质。这些成分的功能失调会导致皮肤屏障缺陷，目前具有代表性的发现是，FLG 的丢失可以破坏表皮内稳态，引起相关的蛋白组学变化，从而导致皮肤屏障和免疫功能障碍［11］。研究发现，伴有FLG基因突变的AD患者表皮金黄色葡萄球菌定植率增加［12］。皮肤屏障功能可受到微生物定植的调节，金黄色葡萄球菌可以激活人组织激肽释放酶（kallikreins，KLKs），降解桥粒黏蛋白1（Dsg⁃1）和FLG 蛋白［13］，而皮肤屏障的功能缺陷又有利于金黄色葡萄球菌穿透表皮，进入真皮。细菌通过受损的屏障增加了变应原与活化的抗原提呈细胞直接接触的机会，可能导致固有免疫反应增加，T 细胞分化为Th2 细胞以及炎症细胞因子驱化，从而进一步破坏皮肤免疫平衡。在有利于Th2分化的免疫环境下，T细胞及B细胞可以相互作用产生过多的IgE，同时记忆性T 细胞再分配到血液循环中，通过免疫反应不仅可导致AD加重，还可引起系统的过敏反应，如食物过敏、哮喘和过敏性鼻炎等［14］。

3.皮肤微生物群与AD：皮肤表面的微生物群落由大量细菌、病毒和真菌组成，它们共同维系着皮肤表面菌群的多样性。宏基因组学研究［15］发现，栖息在皮肤表面的细菌群大部分属于放线菌门、厚壁菌门、变形菌门和拟杆菌门，在这些门属里包含成千上万种不同的种属。特异性的生理差异影响常驻菌群，类似的生理环境有相似的微生物群落分布，如大肠杆菌栖息在干性部位，放线菌门的丙酸杆菌支配着油性部位，而葡萄球菌和棒状杆菌则控制着湿性区域。同时，微生物感应和信号传递机制、代谢途径及免疫原性特征等可能表现出与宿主维持相互作用的位点特异性［16］。与皮肤微生物在特定位点分布类似，相应的皮肤疾病也通常出现在特定的部位，而细菌群落的分布特点又会受到宿主年龄、性别和人种等的影响，如婴儿期AD 好发于面部和躯干部位，儿童期及青年期好发于四肢屈侧，特别是肘窝及腘窝。

正常皮肤微生物的功能之一是抑制金黄色葡萄球菌的生长，表皮葡萄球菌、人链球菌通过直接产生或刺激宿主产生抗菌肽，这些抗菌肽可高效、选择性地杀死金黄色葡萄球菌，保护宿主免受病原体感染［17］。微生物群落特别是金黄色葡萄球菌生态失衡，在AD的发生和发展过程中发挥着重要作用。金黄色葡萄球菌是一种含有广泛毒力因子的病原体，包括中性粒细胞杀伤毒素、趋化抑制剂、抗吞噬和抗杀伤表面分子、超抗原和免疫逃逸蛋白等。所有金黄色葡萄球菌株均表达超抗原，超抗原与主要组织相容性复合物Ⅱ（MHCⅡ）和T 细胞受体结合，使细胞不受控制的活化而导致炎症；同时，δ 毒素、苯酚可溶性调控蛋白（phenol⁃soluble modulins，PSMs）可激活人角质形成细胞促进炎症细胞因子的表达；而α 毒素可能在破坏皮肤屏障方面发挥作用［18］。AD患者皮肤通常能检测到金黄色葡萄球菌的定植，皮损区与非皮损区的感染率有差异［19］。Kong 等［20］采用DNA 测序技术同时检测疾病稳定期、爆发期和治疗后的皮损区皮肤细菌群，爆发期的细菌多样性低，链球菌属、丙酸杆菌属和棒状杆菌属均不同程度减少，而葡萄球菌属的相对丰度上升，此外还检测到低丰度菌属如罗斯氏菌属的丰度在3 种疾病状态中均有升高。在AD 急性发作期金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌均明显增加，提示二者也可能是互利共生的关系。皮肤菌群相对丰度因AD疾病状态的不同而改变，提示了微生物群落与疾病发生之间复杂的相互关系。

4.肠道微生物群与AD：宏基因组研究［21］发现，AD与肠道和皮肤微生物群失调有关，肠道微生物群可能通过免疫、代谢和神经内分泌途径参与AD 的发展。早期肠道微生物的多样性降低与过敏性疾病的风险增加有关［22］，可影响个体对AD发病的倾向，也可影响宿主的健康和后期的疾病状态［23］。一项出生队列研究［24］表明，携带某种超抗原和黏附素基因组合的金黄色葡萄球菌菌株的肠道定植与婴儿期AD的后期进展呈负相关，说明该种菌株的肠道定植可能刺激婴儿免疫系统的发展，减轻AD后续的严重程度。而与健康人相比，AD 患者肠道微生物群中梭状芽孢杆菌、难辨梭状芽孢杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的比例增加，而双歧杆菌、拟杆菌门和拟杆菌属的比例降低［25］。这些研究提示，肠道微生物成分的变化可引起个体免疫系统改变，导致AD的发生与发展。

三、宏基因组学促进新一代的AD治疗

AD 治疗的目标是缓解症状、减轻瘙痒和改善生活质量，通常需要采取多步骤的干预措施以避免相关的触发因素进而改善皮肤屏障，使皮肤机能失调恢复正常及减轻炎症。宏基因组学的出现推动了AD 的微生态治疗新发展。目前针对AD微生物群的多种治疗干预措施已经出现［25］，包括润肤剂、局部糖皮质激素、漂白剂浴、抗生素、益生菌疗法、局部臭氧油、臭氧水疗法和UVB等。

测序分析研究［26］发现，大多数真皮中的微生物不存在于经典的CD11c 吞噬免疫细胞中，金黄色葡萄球菌进入真皮不需要经过抗原提呈细胞，提示微生物不是通过感染的途径进入真皮。皮肤屏障的缺陷可以使微生物的穿透能力增强，虽然微生物不是通过感染的方式直接进入真皮，但是微生物的穿透可以影响细胞因子和抗菌肽（AMPs）的分泌，此炎症触发可能会进一步改变微生物群落，并通过增加皮肤屏障的破坏使疾病持续存在。值得注意的是，皮肤屏障修复可减少金黄色葡萄球菌对皮肤的渗透，并使金黄色葡萄球菌渗透引起的免疫异常恢复正常［27］。

目前，益生菌已被用于治疗多种疾病，包括便秘、过敏反应、婴儿期感染、肠易激综合征以及难辨梭状芽孢杆菌感染引起的结肠炎等［28］。AD小鼠模型研究［29］证实，益生菌合剂可通过调节树突细胞，激活Th1 和Treg 细胞反应，调整T 细胞平衡及减轻AD 的症状。一些益生菌已在预防和治疗AD方面发挥重要的作用，Huang等［30］的一项Meta分析显示，乳酸杆菌、发酵乳杆菌和益生菌混合物可以降低1 ～18 岁亚洲AD 患儿的SCORAD 评分值，而鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌无此作用。用不同益生菌种类或含有乳酸杆菌的混合物治疗AD 比单独使用双歧杆菌菌株显示出更大的益处，然而，益生菌的有效性在1岁以内的婴幼儿中尚未得到证实［31］。也有研究认为，早期的益生菌补充物对AD的防治无明显疗效［32］。益生菌对AD 的作用至今尚没有统一的结论，在不同的实验结果中存在差异，可能取决于多种因素，如特定的益生菌菌株、给药方法、起效时间、治疗时间、剂量及个性化使用等［33］。在AD的治疗中，使用抗生素抑制金黄色葡萄球菌可取得短期的症状改善，但可能会引起皮肤共生菌群失调和增加抗生素耐药性风险。相对而言，共生微生物群有调控皮肤表皮分化和发育基因的作用［34］，且一般不会破坏正常菌群的稳态。所以，AD的微生态治疗显示出很大的应用前景，或许在不久的未来可以在皮肤健康和疾病恢复方面作出更多的贡献。

四、小结

宏基因组测序技术揭示微生物群落对AD 的发生及发展具有重要的影响，可进行多领域分析。微生物之间动态平衡的改变和多样性的减少使致病性微生物定植的概率增加，从而导致皮肤屏障受损及AD病情加重。提示能够通过对局部和系统的微生物群落组成分析可初步诊断、鉴别和推测AD的预后发展。然而，AD是一种复杂的、受多种因素影响的、有明显异质性的疾病，目前尚未明确具体的病因。因此，未来的宏基因组学研究重点在于揭示AD 的发病机制、致病途径以及微生物群落与疾病之间的相互关系，为AD的治疗提供新的思路和策略。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突