Hedgehog信号通路抑制因子SUFU在肿瘤中的作用机制研究进展

林晓敏 综述 谢思明 审校

暨南大学口腔医学院，广东 广州 510632

刺猬信号通路Hedgehog(Hh)信号通路在胚胎和组织发育中起重要作用[1-2]，其异常激活可能与人类多种恶性肿瘤相关，如卵巢癌[3]、口腔鳞状细胞癌[4]、肺癌[5]等。Hh信号通路通过Hh配体与十二次跨膜受体Patched1(Ptch1)的相互作用而启动，减轻了Ptch1对G蛋白偶联受体smoothened(Smo)的抑制作用。这种相互作用触发了胶质瘤相关癌基因同源物(Gli)的激活，激发Hh靶基因的转录[6]。而丝氨酸/苏氨酸激酶Fused抑制因子(Sufu)通过与Gli相互作用并抑制Gli来抑制Hh信号通路。本文就Sufu在肿瘤中的研究进展，主要是针对Sufu调控Gli的机制，以及Sufu蛋白自身的调控研究进行综述，为基于Sufu为靶点的治疗方法提供了相关参考信息。

1 肿瘤中的Hh信号通路

目前研究认为，不同肿瘤类型中异常Hh信号激活可能存在三种机制[7]。一种是不依赖配体的信号传导，即通路成分突变导致的Hh信号通路异常激活。常见的有Ptch1基因突变引起的痣样基底细胞癌综合征(nevoid basal cell carcinoma syndrome，NBCCS)[8]，罕见的，肌肉肿瘤横纹肌肉瘤中也发现了Ptch1和Sufu突变[9]。另外两种为依赖配体的自/近分泌信号和依赖配体的旁分泌信号。哺乳动物分泌三种Hh配体(SHh、IHh、DHh)，SHh配体蛋白通过自分泌(与分泌它的肿瘤细胞结合)或旁分泌(由肿瘤细胞分泌，与附近的基质细胞结合或由基质细胞分泌并被肿瘤细胞吸收)的方式，诱导细胞合成和分泌信号因子以激活Hh信号通路。其传导过程如下：功能性SHh配体表达时，SHh与Ptch1结合，解除Ptch1对Smo的抑制，激活的Smo转移至原纤毛(primary cilium，PC)中，通过某种机制(可能涉及将Gli与Sufu的抑制性复合物解离)在细胞膜上转导Hh信号以激活Gli[6]，最后，激活的Gli进入细胞核转录激活一组特定基因，促进肿瘤生长和侵袭。而这便是SHh经典信号通路途径，后面将简单称之为Hh通路。Ptch1抑制Smo的机制以及Sufu调节Hh信号通路的机制仍不清楚。

2 Hh信号通路中的Sufu

2.1 Sufu在调控Hh信号通路中起关键作用 Sufu基因首先在果蝇中被鉴定，然而哺乳动物中Sufu表现出更为重要的负调控作用。转基因小鼠实验中，敲除Sufu等位基因可导致胚胎死亡，并伴随严重的背部开放性神经管缺损；Sufu+/-杂合子小鼠也出现Hh信号传导增强，且与敲除Ptch1表现的表型一样严重[10]；Sufu+/-p53-/-小鼠个体也可发现与Ptc1+/-小鼠相似的髓母细胞瘤(medulloblastoma，MB)和横纹肌肉瘤[11]，但单独p53基因的缺失小鼠并不会产生上述结果。这些实验提示Sufu缺失对肿瘤的发生与发展具有一定的促进作用。此外，Sufu突变可引起经典的NBCCS，且其患MB的风险是Ptch1突变个体的20倍高[12]。NBCCS某些表型特征，如手掌硬化性纤维瘤特征[13]、漏斗型囊性基底细胞癌[14]等在具有Sufu突变的个体或家庭中更为普遍。生殖系Sufu突变导致的MB常发生在3岁以下的患者中，其预后通常比普通SHh MB者差[15]。王美等[16]研究发现Sufu的突变可以促进MB，其细胞实验也证实了Sufu通过结合Gli蛋白从而抑制其功能。皮肤错构瘤[17]中也发现了Sufu相关基因的突变。综上所述，无论Hh配体存在与否，Sufu蛋白的失活都足以激活Hh信号通路，与多种人类肿瘤密切相关。这与Sufu在Hh信号通路中起关键抑制作用是相符合的。然而，有研究发现Hh诱导的Gli转录激活可能独立于Sufu而发生，Sufu的活性降低可以减少Hh对高阈值神经管凋亡的诱导[18]。这提示Sufu可能在Hh信号通路中还存在正向调节作用。YIN等[19]最近证明了Sufu通过维持强大的Gli活性，在Smo激活的MB中起促肿瘤作用，确立了Sufu在SHh MB中的双重作用。这些研究提示Sufu在肿瘤中的生物学功能可能存在两面性。

2.2 Sufu调节Gli机制 大量研究揭示Sufu通过多种机制调节Gli(锌指蛋白Gli1、Gli2和Gli3)的转录活性，抑制Hh信号传导。但Sufu调控Hh信号通路的机制仍存在争议，这一直是这个领域的研究热点。细胞质中，Sufu通过结合Gli阻止Gli蛋白进入细胞核，最终调节Hh通路活性。研究发现，Sufu与核转运受体蛋白importinβ1竞争结合Gli1的相同位点，阻碍importinβ1介导的Gli1的核易位[20]。Sufu和importinβ1的相对细胞内浓度可能决定Gli1的定位，从而影响其在肿瘤以及发育系统中的作用。Sufu还通过掩盖Gli的核定位序列，阻碍由核蛋白β2(karyopherinβ2)介导的Gli2/3的核积累[21]。Sufu在细胞质中调控Gli过程如图1[22]。没有功能性Hh配体时，PC相关驱动蛋白(Kif7)、Sufu和全长Gli2/3组成胞质蛋白复合物。该复合物被蛋白激酶A(PKA)、糖原合酶激酶3(GSK3)和酪蛋白激酶1(CK1)磷酸化，随后高磷酸化的全长Gli2/3蛋白经SCF(Slimb/β-TrCP)泛素连接酶介导而部分降解，截短了C端转录激活域，水解为Gli阻遏物(GliR)。GliR移动至细胞核内与全长的GLI2/3竞争相同的调节序列，抑制了Hh靶基因表达。当Hh配体表达时，激活的Smo使得Sufu-Gli复合物募集到PC末端，随后复合物快速解离，释放出全长Gli2/3。Gli2/3作为Gli激活剂(GliA)取代GliR进入细胞核，与靶基因启动子结合，并激活Hh靶基因的转录。最近有实验显示，Sufu是一个胞质穿梭蛋白，Sufu伴随着GliA和GliR进入细胞核[23]，可能促进GliA迅速从细胞核中输出。细胞核内，Sufu可与DNA分子中的Gli结合序列结合并阻止基因转录，还能通过招募SAP18-mSin3-HDAC转录共抑制复合物来抑制Gli的转录活性[24]。此外，CHUWEN等[25]发现Sufu还可以募集p66β(核小体重构和组蛋白脱乙酰基酶NuRD的阻遏物复合物的成员)来阻断Gli介导的Hh靶基因表达。而Hh途径激活导致Sufu/p66β与Gli分离，促进Gli蛋白活性。Sufu对Gli的综合调控主要靠调控GliR和GliA的浓度比值，以维持梯度Hh通路活性[26]，这对于实现多细胞生物中Hh通路的复杂生理功能至关重要。还有研究发现，细胞核内Sufu的定位与Gli蛋白有关，Sufu在核内的稳定性受Gli蛋白家族成员调控[27]。这表明，Sufu本身活性也受到Hh信号调控，进而控制靶基因的表达。Sufu是Hh通路中最保守的成分之一,Sufu与Gli蛋白的物理解离是Hh通路激活的主要特征。因而，对Sufu蛋白结构的探索，有助于解释Sufu和Gli之间的物理相互作用。Sufu蛋白晶体单体由两个球状域组成，即NTD(氨基末端域)和CTD(羧基末端域)，两者之间有一个短的连接子。有文献报道，细胞质中Sufu可以通过其NTD来束缚的Gli蛋白，而细胞核中，则通过其CTD抑制Gli[28]。Sufu蛋白的两个结构域采取β片叠加的方式将Gli夹在中间，呈现出封闭构象[29]。Hh激活诱导Sufu由封闭转变为开放构象，导致Sufu与Gli蛋白SYGHL序列之间的相互作用降低，具体的机制尚不清楚。王美等[16]发现突变位点R146X、R299X、R430X3处的Sufu突变体破坏了和Gli的结合，这为深入了解Sufu结构的改变影响其功能提供了条件。可见，Sufu与Gli结合界面在Sufu调控Gli中起着至关重要的作用，介导结合界面的关键氨基酸残基突变可以破坏Sufu-Gli蛋白之间的相互作用从而调控Hh信号通路，值得未来深入研究。综上所述，Sufu参与调节Gli蛋白以及Hh信号从细胞质到细胞核的转导，通过调节Gli的亚细胞定位和稳定性，实现Gli蛋白在Hh信号梯度下的分级活性。这些复杂的调控依靠Sufu与Gli之间的物理相互作用以及其他因素共同作用。

3 Sufu蛋白活性的调节

相较于Sufu在调控Gli方面的较广泛的研究，Sufu蛋白自身活性的调控仍较模糊。近来研究发现，翻译后修饰将影响Sufu蛋白的稳定，从而影响肿瘤的发生发展。

Hh通路激活能诱导Sufu多聚泛素化，使Sufu随后被蛋白酶降解失去稳定性，这可能促进了肿瘤的发生。最近的一项研究表明，MB中E3泛素连接酶SCF(Skp1-Cul1-F-box)蛋白Fbxl17(F-box和富含亮氨酸的重复蛋白17)在细胞核中能够靶向的Sufu蛋白水解，使Gli1从Sufu-Gli1复合物中释放出来以进行适当的Hh信号转导，促进MB的形成[30]。这表明，泛素-蛋白酶途径介导的降解对Sufu在翻译后水平的调控具有重要意义。同样的，磷酸化也在调节Sufu稳定性中起重要作用。与泛素化作用相反，糖原合成酶激酶-3(GSK3 β)、环 磷 酸 腺 苷 (cyclic adenosine monophosphate，cAMP)、PKA等引起的Sufu磷酸化，可促进其稳定化。当Hh通路激活时，Sufu被转运出PC并通过蛋白酶途径降解。PKA和GSK3β在Ser-346和Ser-342处的双重磷酸化可以延长Sufu在PC中的停留时间并稳定蛋白质[31]。廖恒青等[32]研究发现Sufu发生磷酸化修饰后对MB的抑制作用增强而非磷酸化的Sufu突变体抑癌作用明显减弱，该研究还认为磷酸化Sufu主要聚集在细胞核。WANG等[33]通过酵母双杂交实验筛选鉴定了丝氨酸/苏氨酸激酶Nek2A是一种与Sufu相互作用的蛋白酶。该酶可以在细胞质中磷酸化并稳定Sufu，从而抑制Hh/Gli2信号通路。上述实验证实了泛素化使Sufu失稳而磷酸化稳定Sufu的作用。然而，INFANTE等[34]最近提出了泛素化对Sufu调节的新机制，他们在MB中发现具有HECT(与E6相关的蛋白质羧基末端）结构域的E3泛素连接酶Itch，它与衔接蛋白β-arrestin2的复合物可以结合Sufu，促进Sufu的K63连接泛素化。但该过程并不会影响Sufu的稳定性，反而促进Sufu-Gli3复合物的形成，增加Gli3R的量，阻断Hh通路。这证明Itch介导的Sufu泛素化能抵抗MB肿瘤形成。该研究还发现Sufu的突变体则对Itch介导的泛素化不敏感，能刺激MB发病。

上述研究结果表明，磷酸化和泛素化等翻译后修饰的过程，很可能复杂精密地调节Sufu蛋白的稳定性，影响其肿瘤调控作用。目前还需要更多的研究来揭示其他的调控和它们之间的关系。

除了翻译后修饰，许多外泌体也能影响Sufu蛋白表达活性从而调节肿瘤的生长。早前有研究发现，miR-378可以通过减弱Sufu和TUSC2(肿瘤抑制因子候选基因2)的翻译来促进细胞存活、肿瘤生长和血管生成[35]。miR-214可以直接靶向Sufu mRNA并破坏其功能，从而促进肺腺癌的上皮-间质转化(EMT)和转移[36]。近期在乳腺癌中还发现其他调节因子，如lncRNA GAS5(长链非编码RNA生长停滞特异性转录本5)通过靶向miR-378a-5p/Sufu信号传导促进三阴性乳腺癌细胞凋亡[37]。LIFR-AS1(白血病抑制因子受体反义RNA1)与miR-197-3p竞争结合而上调Sufu，抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移[38]。miR-423-5p[39]、miR-224[40]、14-3-3ζ(调节蛋白)[23]近期也被发现与Sufu共同作用调控胃癌、膀胱癌、宫颈癌的癌细胞增殖和迁移以及肿瘤生长和转移。然而各类外泌体对Sufu具体的调控机制尚不明确，以Sufu自身为核心的调控体系仍需不断探索。

4 展望

Hh信号传导异常涉及多种人类恶性肿瘤的发生与发展，尽管已有许多相关研究，通路级联内的机制仍然难以捉摸。目前Hh信号通路在肿瘤治疗方面的研究主要是Smo抑制剂[41-42]的开发，这对通路下游基因突变以及Hh信号非经典传导途径形成的肿瘤有较大的局限性。本文综述了Sufu对肿瘤中Hh信号通路的影响以及Sufu调控Hh信号通路的机制，还讨论了Sufu蛋白自身活性的调控。确定了Sufu-Gli复合体在Hh通路中重要的地位，并从多方面解析了Sufu对肿瘤的调控作用。为基于Sufu为靶点的治疗方法提供了相关参考信息。