白藜芦醇在绝经后骨质疏松症中抗氧化机制的研究进展

邱俊杰 王伟舟 赵泽玉 袁勇*

1.昆明医科大学第二附属医院，云南 昆明 650033 2.昆明医科大学第一附属医院，云南 昆明 650032

绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis，PO) 由雌激素缺乏和衰老引起，其特征是低骨密度(bone mineral density, BMD)和骨组织的微结构恶化，并增加了骨质疏松性骨折的风险[1]。PO的发生除了个体的遗传因素外，也与年龄、饮食、运动量等多方面因素相关。PO已成为一个全球性的公共卫生问题，据相关资料统计，三分之一的成年女性在其一生中会受到PO及相关骨折的影响[2]。随着全球人口老龄化，骨质疏松症的患病率还将持续上升，因此更好地阐明PO潜在的发病机制并寻找有效的抗PO药物成为目前的研究热点。

目前的研究表明，PO的发生与雌激素水平的下降和氧化应激(oxidative stress，OS)水平的升高密切相关。其中，OS是PO最主要的发病机制之一。人体正常状态下的抗氧化机制是完美的，可以通过酶催化和无酶催化消除氧自由基，从而起到抗氧化作用。当氧自由基特别是活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生增多与抗氧化处理自由基的能力不平衡时，导致OS。OS发生后可造成对骨细胞和成骨细胞的氧化损伤，骨重建失衡，使骨吸收超过骨形成，从而导致PO的发生[3]。

白藜芦醇(Resveratrol，RES)是一种多酚植物雌激素(反式-3,5,4'-三羟基二苯乙烯)，能够从红葡萄、红葡萄藤、花生和虎杖根等植物中提取[4]。RES具有增强自身免疫力、抗菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、保护心血管等多重功效[5]。研究表明RES可以改变骨细胞的新陈代谢，并具有调节骨转换的能力，是一种天然的抗氧化剂，能有效地防止体内由氧化应激引起的骨量丢失，从而达到治疗PO的作用[6]。RES亦能够与雌激素受体结合，发挥雌激素样作用，弥补了雌激素缺乏带来的骨质流失[5]。

1 绝经后骨质疏松与氧化应激

近年来，尽管在了解雌激素缺乏如何诱导PO方面取得了显著进展，但PO的发生并不能完全归因于雌激素的缺乏。研究发现仅仅通过补充雌激素并不能完全改善由衰老和疾病导致的各种PO，其潜在的致病机制是复杂和多方面的[7]。到目前为止，ROS在PO中的作用已被充分证明。在正常生理条件下，ROS在线粒体中不断产生，但ROS的过量积累将导致细胞膜、细胞质以至于最终DNA的损伤[8]。这一系列变化在造成了骨细胞和成骨细胞氧化损伤的同时，刺激破骨细胞从其前体分化，导致骨吸收增加[9]。也就是说，OS确实参与了骨量的调节，并且是PO的罪魁祸首[10]。

另外，OS也与雌激素的缺乏密切相关。体外和动物实验表明，雌激素缺乏增加了ROS的产生并减弱了细胞的抗氧化防御能力，导致氧化物质的积累，而这些氧化物质又能够刺激破骨细胞形成，增加骨吸收活性[11-12]。因此，雌激素具有通过充当抗氧化剂来保护骨骼抵抗OS的能力[13]。

2 白藜芦醇在治疗绝经后骨质疏松症中的抗氧化机制

RES作为一种天然的抗氧化剂，可以有效地防止体内由OS引起的骨量丢失，从而达到治疗PO的作用。其中涉及的抗氧化机制包括：通过激活SIRT-1促进间充质干细胞的成骨分化，通过上调FoxO1抑制RANKL诱导的破骨细胞分化，通过抑制 p66shc 的磷酸化抑制成骨细胞凋亡，通过激活Wnt /β-catenin信号传导促进成骨细胞增殖。RES还可作用于脂肪细胞和成骨细胞中的几个分子靶标，导致脂肪细胞的减少以及成骨细胞的增加。接下来将对以上几个机制展开描述。

2.1 白藜芦醇通过激活SIRT-1促进间充质干细胞成骨分化

间充质干细胞(MSC)是多能细胞，可以分化成不同类型的结缔组织细胞(即成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞等)[14]。它们的寿命和功能受到OS的影响。通常增加的ROS可抑制MSC增殖，增加衰老，增强脂肪形成但减少成骨分化。在MSC中，过多的ROS能明显上调与脂肪细胞分化相关的基因，如 PPARγ2，同时下调与成骨细胞分化相关的基因，如 Runx2[15]。已知SIRT1(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性脱乙酰酶sirtuin的家族成员，被发现是一种抗衰老基因)通过结合核受体辅阻遏物(N-CoR)间接地抑制PPARγ2的表达，以抑制脂肪生成[16]，并通过激活RUNX2依赖性基因转录促进成骨[15,17]。由OS产生的过量ROS可导致SIRT1蛋白的表达明显受抑，进而使RUNX2表达降低，PPARγ2表达增加。因此，在ROS过量的情况下，MSC分化偏向于脂肪细胞[5]。

已知RES是SIRT1的活化剂，通过激活SIRT1，上调了RUNX2和骨钙素(OCN)的表达，同时抑制了脂肪形成中的PPARγ2表达，从而促进了自发性骨生成，并阻止了间充质祖细胞的脂肪形成[18]。所以，在OS导致的SIRT1蛋白表达明显受抑的情况下，RES以其抗氧化作用激活了SIRT1并促进了MSC的成骨分化，从而发挥了抗PO的作用。

2.2 白藜芦醇通过上调FoxO1抑制RANKL诱导的破骨细胞分化

破骨细胞受各种促破骨细胞生成以及抗破骨细胞生成细胞因子的影响，可分别刺激或抑制其活性[19]。已有研究表明，这些细胞因子可以直接通过与其位于破骨细胞上的特异性受体结合或经由NF-κB(RANK)/RANKL/ OPG系统对破骨细胞产生影响[20]。RANKL是肿瘤坏死因子(TNF)家族的成员，通过与RANK形成复合物来触发破骨细胞生成并增加骨质流失，是骨量丢失的主要介质[21]。OPG作为RANKL的抑制剂，与RANK相结合以拮抗RANKL的作用，从而抑制骨量丢失[22]。

在更年期，铁超载及其促发的OS会引起骨生成的生化标志物显著下降，并通过OPG / RANKL信号传导途径增强破骨细胞生成[5]。动物实验表明，通过ROS介导的反应，铁可以诱导氧化和抗氧化的不平衡，使Runx2，、OCN和I型胶原蛋白表达减少，导致小鼠的骨质流失。而RES能够反转过量铁导致的以上变化，并维持小鼠的抗氧化/促氧化平衡[23]。RES还能够通过改善OS状态增强OPG / RANKL的比例(即OPG的表达增强与RANKL的表达降低)，抑制破骨细胞生成，最终减弱骨吸收并防止体内骨量丢失[24]。

在分子水平上，已证实RES抑制PO中破骨细胞的生成以及对氧化损伤的保护是通过抑制PI3K/ AKT信号通路上调FoxO1的转录活性实现的[25]。在ROS发生时，细胞通过上调抗氧化酶或DNA损伤修复基因的表达来保护自身免受ROS的不利影响。该反应包括去磷酸化和FoxOs转录因子的活化[25]。FoxOs转录因子属于叉头框蛋白家族中的一个亚类，它由四个成员组成：FoxO1，FoxO3a，FoxO4和FoxO6，主要参与细胞凋亡、DNA修复和清除ROS过程[26]。国内外多项研究[27]表明，FoxO1可通过激活下游抗氧化基因的表达同时上调抗氧化酶(谷胱甘肽过氧化酶和超氧化物歧化酶)的表达来抵消ROS的产生，发挥重要的抗OS作用。而FoxO1的活化通常受PI3K/ AKT信号通路的抑制，阻止FoxO1易位进入细胞核，从而抑制了FoxO1的抗氧化作用。Bartell等[28]阐明M-CSF(巨噬细胞集落刺激因子)和RANKL通过激活AKT抑制FoxO1转录降低了过氧化氢酶蛋白的水平,并促进了破骨细胞中过氧化氢(H2O2)的生成，而H2O2的产生有助于破骨细胞的形成和骨吸收，以此形成的恶性循环导致了PO的发生。动物实验表明，用RES治疗去卵巢大鼠，通过抑制PI3K/ AKT信号通路上调FoxO1的转录活性，FoxO1的转录被激活，提高了抗氧化酶水平，并抑制破骨细胞中H2O2的产生，最终抑制破骨细胞生成。因此，FoxO1可能是RES发挥抗PO作用的新型有效靶标[24]。

2.3 白藜芦醇通过抑制 p66shc 的磷酸化抑制成骨细胞凋亡

年龄依赖性骨量减少与ROS水平的逐渐增加、骨中衔接蛋白p66shc的磷酸化有关[29]，Almeida等[30]的实验证明了p66shc是H2O2造成成骨细胞凋亡的重要介质。p66shc是一种氧化还原酶，可增加线粒体ROS生成并刺激细胞凋亡。细胞内ROS增加时，p66shc通过在Ser36(丝氨酸36)处的PKCβ(促凋亡信号激活蛋白激酶Cβ)介导下发生磷酸化而被激活，并将氧化信号转化为凋亡信号。磷酸化的p66shc易位至线粒体，并作为氧化还原酶通过产生H2O2来扩增ROS，增加的H2O2导致细胞线粒体通透性转换孔打开继而导致细胞凋亡[31]。RES可通过抑制 p66shc 的磷酸化，阻止成骨细胞凋亡，消除了OS对成骨细胞的不利影响，发挥抗PO作用[30]。

P66shc磷酸化使ROS产生增多导致的许多后果之一是使以NF-κB为靶标的转录增加[32]。NF-κB是广泛存在于真核细胞中的一种转录因子，在未受刺激的细胞中，NF-κB因其与内源性IκB激酶(IKK)的紧密结合而被隔离在细胞质中。ROS产生增多使IKK的磷酸化和降解破坏了这种关联，导致NF-κB活化并允许NF-κB易位到细胞核中，一方面使成骨细胞功能受抑，另一方面使RANK与RANKL相互作用促进了破骨细胞的分化[33]。Wang等[22]的研究证实，RES通过激活IKK表达，抑制了PO大鼠NF-κB的表达，使破骨细胞分化受抑。已发现雌激素受体(ER)以配体依赖的方式直接抑制NF-κB的转录。由于ER在成骨细胞中表达，在生理条件下雌激素可能负调节NF-κB的活性。然而，在PO的发病机制中，由于缺乏雌激素，这种负调节可能会减少，从而导致成骨细胞中基础NF-κB活性的升高，继而使骨形成减少，骨吸收增加，导致了PO的发生[32-33]。RES以其雌激素样作用直接抑制NF-κB转录，维持骨形成，抑制骨吸收，以此来对抗PO的发生发展[5]。

2.4 白藜芦醇通过激活Wnt /β-catenin信号传导促进成骨细胞增殖

研究表明，Wnt /β-catenin信号传导的激活可促进成骨细胞增殖[34]。当Wnt配体与卷曲受体结合时，该信号通路即被激活。同时β-catenin在细胞质中积累并易位到细胞核中[35]，在那里它与T细胞因子/淋巴细胞生长因子(TCF / LEF)结合进入复合体，从而促进多种靶基因的转录，包括那些参与成骨细胞分化和存活的基因[36]。Wnt信号传导可以被几种细胞外和细胞内抑制剂下调。后者包括FoxOs。FoxOs通过与β-catenin结合并阻止β-catenin与TCF / Lef的结合而下调Wnt信号传导[37]。

在OS状态下，成骨细胞通过FoxOs与β-catenin竞争性结合，增加自由基清除酶的转录从而发挥抗氧化作用。其代价是减少了β-catenin与TCF的结合[38]，使β-catenin / TCF介导的转录转变为FoxOs介导的转录，并导致β-catenin的减少，由此使Wnt信号通路的传导受到影响，抑制了成骨细胞的增殖和分化，最终形成了OS诱导的PO[39]。然而Sirt1能使FoxOs发生脱乙酰化从而抑制FoxOs与β-catenin的结合，增加成骨细胞祖细胞的增殖、成骨细胞的数量和骨骼的形成[40]。RES通过激活Sirt1，减少FoxOs与β-catenin的结合，并抑制β-catenin数量的下降，继而激活Wnt /β-catenin信号传导促进成骨细胞增殖[34]。

3 总结与展望

绝经后骨质疏松症是一种与衰老有关的常见病，由于雌激素缺乏导致骨量减少，结构恶化，骨强度降低，骨折风险增加。绝经后骨质疏松症是一个主要的公共问题，据估计全球每年有900万例骨折，因此阐明其潜在的发病机制，制定有效的预防策略势在必行。雌激素缺乏被认为是骨质疏松症的主要原因，但最近的流行病学证据和机理研究表明，衰老和相关的活性氧增加是近端致病因素。氧化应激随着衰老而增加，这与绝经后骨质疏松症的病理生理学有关。白藜芦醇是一种具有抗氧化和抗衰老作用的天然抗氧化剂。它可以通过多种通路抑制氧化应激，改变骨细胞的新陈代谢，并具有调节骨转换的能力，可强烈地防止体内由氧化应激引起的骨量损失，从而治疗绝经后骨质疏松。其中涉及的机制包括：激活SIRT-1促进间充质干细胞的成骨分化，上调FoxO1抑制RANKL诱导的破骨细胞分化，抑制 p66shc 磷酸化从而抑制成骨细胞凋亡，激活Wnt /β-catenin信号传导促进成骨细胞增殖。其还可作用于脂肪细胞和成骨细胞中的几个分子靶标，导致脂肪细胞的减少以及成骨细胞的增加。同时，随着对于白藜芦醇在绝经后骨质疏松中的研究与进展，白藜芦醇的有益作用已广为人知，但其部分作用机制还有待研究，需要我们共同努力，让白藜芦醇更好的造福人类。