肌源性干细胞造血分化的研究进展

韩远豪 杜亚格 窦昊颖 王晓玲 汪涛

白血病、多发性骨髓瘤、恶性淋巴瘤和骨髓增生异常综合征等恶性血液病具有发病率高、治疗难度大和预后较差等特点，一直威胁着人类的生命和健康[1]。长期以来，临床上对于恶性血液病的治疗主要以化学治疗、激素治疗、免疫抑制剂治疗以及使用富含造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSCs)的骨髓移植等为主要治疗手段。但化疗药物、免疫抑制剂等缓解疾病发展的同时也会造成严重的不良反应，如呕吐、毛发脱落、食欲缺乏、手脚麻木、免疫力降低等。骨髓移植作为根治恶性血液病的唯一方法，寻找与患者配型相同的骨髓费时费力，花费昂贵，且其中所含干细胞数量有限，大大限制了其在临床的广泛应用，成为血液病治疗中的难题。肌源性干细胞(MDSCs)是一种来源于骨骼肌中具有自我更新、多向分化潜能的成体干细胞，在无诱导因素作用下可定向分化为骨骼肌细胞，在特定条件下不仅能分化为中胚层细胞类型，如成肌细胞、成骨细胞、软骨细胞、内皮细胞和造血谱系，还可以打破胚层的限制分化为外胚层和内胚层的细胞类型[2,3]。研究发现，MDSCs能够表达HSCs的标志物Sca-1和CD34，在造血微环境下可以促进造血重建，通过移植到小鼠内产生的造血活性要强于骨髓移植，且MDSCs系自体来源，具有取材容易、利于体外培养扩增、免疫原性低等优点，因此将成为重建造血最有希望的种子细胞来源之一[4-6]。本文将对近年来课题组关于MDSCs造血分化过程中机制的研究现状、存在的问题以及应用前景进行综述。

1 MDSCs的概述

1.1 MDSCs的分离 MDSCs可来源于骨骼肌、心肌和平滑肌[7]。但目前文献中报道较多的方法均采用来自骨骼肌的组织进行分离培养。从解剖学的角度来看，肌肉中存在两种类型的干细胞，其中位于肌纤维基板和质膜之间的是卫星细胞(也称为肌肉干细胞)，可以与受损的肌原纤维融合，再生肌纤维。另一种细胞是MDSCs，它不位于卫星细胞壁龛中，在适当的条件下可以定向分化为不同的细胞谱系[8,9]。这在其他研究中也得到了证实，例如，Jackson等[10]在1999年从小鼠的骨骼肌中分离出一种干细胞，它与卫星细胞明显不同且表达造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)的表面标志Sca-1和c-Kit，通过将培养的干细胞移植入受致死剂量辐照的受者体内，发现其产生的造血活性是整个骨髓的10～14倍，具有强大的造血分化能力，这说明卫星细胞与MDSCs是两种不同的细胞。

目前大多数获取MDSCs的方法都涉及肌肉活检。例如利用小鼠的骨骼肌分离MDSCs，取4～5日龄的乳鼠，分离骨骼肌，剔除脂肪、筋膜、神经和血管等，通过机械剪切方式将骨骼肌剪碎，后采用胶原酶和胰蛋白酶等分步消化，可使80%～90%的MDSCs从肌肉组织的不同解剖位置释放出来[11-13]。但是，在使用酶消化法分离MDSCs时，应严格掌握酶消化的时间，消化时间过长会导致MDSCs的过度消化，影响其生长状态，若消化时间过短，则无法充分分解蛋白，会使获得的MDSCs数量减少[14]。酶消化法的另一个缺点是对组织有较大的破坏性，会影响细胞的增殖与分化活性[7]。文献表明，目前最常用于分离MDSCs的方法是preplate技术[15]，但是此方法在应用过程中较复杂和耗时。因此，Xu等[16]对preplate技术进行了改良，以开发一种更有效的获取和培养MDSCs的方法。在结合了多步酶消化法和preplate技术的基础上，还改良了培养基和培养器具，结果显示，改良方法可显著缩短MDSCs的分离过程，是一种快速、有效的从小鼠骨骼肌中分离和纯化MDSCs的方法。

1.2 MDSCs的纯化 由于肌肉组织中含有的MDSCs较少，酶消化法分离获得的MDSCs中常混有血管内皮细胞、血细胞和成纤维细胞等，并非单纯的MDSCs，因此，建立一种高效的MDSCs纯化方法尤为必要，也是当前研究中需要克服的难题之一。目前MDSCs的纯化方法包括差速贴壁法，密度梯度离心法、流式细胞术和免疫磁珠法。流式细胞术虽然能获得高纯度的MDSCs，但因其实验要求过高，且成本昂贵，因此并不作为首选方法。目前最常用的方法是根据MDSCs的物理特性，即差速贴壁法进行MDSCs纯化[7]。

差速贴壁法的原理是，非MDSCs成分贴壁能力较MDSCs强，贴壁时间较短。利用此特点通过预贴壁和转瓶换液的方式将未贴壁的MDSCs细胞悬液移至新瓶，重复操作即可完成MDSCs的纯化。此方法的优势是获得细胞的纯度可高达90%，且对细胞的损伤较小，缺点是操作步骤较繁琐，细胞污染的概率增加[2]。丁维进等[17]利用改良的差速贴壁法从3～5日龄的C57小鼠骨骼肌中分离纯化得到了高纯度的MDSCs，且MDSCs可以保持较好的细胞形态的增殖能力，这表明差速贴壁法是一种高效的MDSCs纯化技术。

较为理想的纯化方法是根据细胞表面的特异性标志物进行筛选。磁珠分选法是近年来新兴起的一种细胞筛选技术，应用抗原-抗体反应的原理对具有特定标记的细胞进行分选，实验操作简单，获得目标细胞纯度高且不会破坏细胞活力。但目前尚未发现MDSCs的特异性标志物，HSCs标志物Sca-1是目前公认的MDSCs标志物[18,19]。本课题组刘志强等[20]利用磁珠筛选法获得纯度超过90%的Sca-1+MDSCs，且保持了一定的细胞活力。不足的是，筛选后获得的细胞数量，可能是在实验过程中损失了部分细胞。因此，在今后的研究中，不断完善MDSCs的纯化过程，提高纯化效率依然是我们科研工作者的重要任务。

1.3 MDSCs与HSCs的关系 MDSCs与HSCs有着密切的关系，在细胞来源、增殖分化以及蛋白表达方面有着异同点。二者同属于干细胞范畴，具有干细胞自我更新、高度增殖、多向分化的潜能。MDSCs主要存在于骨骼肌组织，但也可从平滑肌中分离获取。HSCs是各类血细胞的始祖细胞，存在于骨髓之中。当机体需要时，其中一部分分化为成熟血细胞，另一部分进行分裂增殖，以维持HSCs的数量相对稳定，维系着造血系统的动态平衡[21]。而MDSCs与HSCs的增殖分化方式有着相似之处，经激活之后其中一个子细胞分化成肌管细胞，另一个则通过复制形成新的MDSCs[22]。此外，在目前的研究中，二者共同表达的蛋白包括CD34，CD45，Sca-1等，不同的是，HSCs表达c-kit、Try1、Ly6G、CD3、CD4、CD5等成熟造血细胞标志物，而MDSCs则表达desmin、MyoD等肌源性标志物[23]。因此，明确MDSCs与HSCs之间存在的关联对于今后的实验研究及临床应用至关重要。

2 MDSCs的造血分化

2.1 造血微环境在造血过程中的重要作用 造血微环境又称为造血细胞龛(niche)，根据位置和功能的不同将其分为两大类，即骨内膜微环境和血管微环境。造血微环境主要是由骨髓中邻近HSCs的支持细胞构成，包括成骨细胞、内皮细胞、CAR细胞、nestin+细胞、破骨细胞、巨噬细胞和施万细胞等[24]。这些细胞对维持HSCs的自我更新及增殖分化起着关键作用。

研究发现，造血微环境中的多种骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)在正常生理状态下主要通过分泌细胞因子、白介素或其他活性物质等调控造血干/祖细胞的增殖、分化和发育，例如干细胞生长因子(SCF)[25]。Ding等[26]利用基因敲除技术在各BMSCs中特异性敲除SCF，结果发现当敲除内皮细胞中SCF时骨髓内HSCs数量下降明显，不仅证明了SCF对HSCs增殖分化的重要性，同时也提供了内皮细胞作为SCF主要来源的证据。此外，趋化因子12(CXCL12)是也造血过程中一种必不可少的细胞因子，而富含CXCL12的网状细胞(CXCL12 abundant reticular cell，CAR细胞)则是构成造血细胞龛的重要组成细胞，在整个造血活动中扮演着重要角色[27]。

此外，造血微环境中还存在着多种信号通路，如Wnt信号通路，Notch信号通路，BMP/TGF-β信号通路以及JAK2-STAT5信号通路等。这些信号通路与BMSCs共同参与HSCs的自我更新和定向分化，维持造血微环境的稳定。一旦造血微环境紊乱，就会引发诸如再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征甚至是白血病等恶性血液病[28]，因此，造血微环境的稳定对HSCs的增殖分化至关重要，明确造血微环境的细胞组成和分子机制对于了解血液病发病机制和临床治疗有重要意义。

2.2 BMSCs对MDSCs的造血分化的诱导作用 成骨细胞是构成骨内膜微环境的主要组成细胞。Calvi等[29]应用甲状旁腺激素相关肽(parathyroid hormone related peptide，PTHrP)刺激经基因改造产生成骨细胞特异性活化的PTH/PTHrP受体(PPRs)4的小鼠，结果显示成骨细胞的数目增加，而HSCs的数目也随之增加。Galán-Díez等[30]发现成骨细胞已成为HSCs增殖的有效调节细胞，既可以调节HSCs的募集，又可根据其分化阶段，沿着淋巴系、髓系和红细胞系增殖分化。此外，成熟成骨细胞突变还可诱发髓系恶性肿瘤。表明了成骨细胞对HSCs具有一定的调节作用。

内皮细胞是血管微环境的主要组成细胞。张滢等[31]通过输注内皮祖细胞(EPC)联合小鼠异基因骨髓移植(allo-BMT)，观察经60Co照射后小鼠骨髓内皮细胞(EC)的修复情况,并进一步观察其对造血重建的影响。免疫组化及血液指标检测的结果表明，EPC输注联合allo-BMT组骨髓内皮细胞的修复及造血功能的恢复情况要好于单独移植组，表明了内皮细胞对维持造血微环境的稳定发挥着重要作用。

而MDSCs在造血分化过程中同样受到BMSCs的影响。本课题组王晓玲等[32]通过模拟体外造血微环境，探讨经典药方当归补血汤于造血微环境中对MDSCs造血分化的影响，首先将培养3 d的MDSCs进行当归补血汤载药血清和经当归补血汤干预后的BMSCs条件培养基干预，然后鉴定肌源性的标志蛋白desmin，并进行抗CD45的免疫组化染色与图像分析。实验结果显示，相对原始的MDSCs其CD45表达的量要多，而随着细胞分化成熟，desmin表达的量增多，CD45表达的量开始减少，呈下降趋势。并且以含当归补血汤载药血清和BMSCs的培养基培养的MDSCs，CD45表达量要高于正常血清组及单纯载药血清干预组。而CD45是目前造血细胞生长发育、活化及凋亡过程中起重要调控作用且具有相对特异性的造血细胞标志物，这表明BMSCs对MDSCs的造血分化起促进作用，且在中药干预下，随剂量的增加MDSCs向造血分化的现象更加明显。此外，课题组刘志强等[33]为探究BMSCs对MDSCs体外造血分化的影响，利用混合酶消化联合磁珠分选法分离出更加纯化的MDSCs，通过Transwell小室将BMSCs和MDSCs进行共培养，模拟造血微环境，并通过Western Blot方法检测造血细胞标志物CD34和CD45的表达含量。实验数据显示共培养体系中MDSCs的CD34和CD45表达量要明显高于MDSCs单独培养组。另外，当MDSCs单独培养时细胞呈梭形和纺锤形，并逐渐融合，形成多核肌管。而共培养组除少量贴壁细胞呈梭形或菱形外，还出现大量悬浮的小圆型细胞，表现出克隆性生长的特点。这表明MDSCs在无诱导条件下易向成肌方向分化。而在造血微环境中，MDSCs表现出造血特性，从而说明了BMSCs对MDSCs的造血分化具有诱导作用，但其中的具体机制尚未明显，仍需要在今后的实验中不断探索。

2.3 信号通路对MDSCs造血分化的调控作用 在医学科学技术日益发达的今天，对各类疾病发生发展的过程及临床诊疗过程中存在的机制研究已经成为众多医学科研工作者研究的方向，其中信号通路的研究则是当下的热门。而HSCs的生长发育、自我更新及分化过程不仅需要造血微环境中BMSCs和细胞因子的干预，还需要依靠多种信号通路的调控作用以达到稳态。

研究表明，Notch信号通路在HSCs中高度活化，而分化之后如在成熟的血细胞和外周淋巴器官中很少被检测到，并且在骨髓和外周血中也检测到Notch信号通路的活性在造血分化时下调。此外，当阻断Notch信号时可以发现体外HSCs分化加速且体内的干细胞数量减少[34]。Wnt信号通路中经典的Wnt3a/β-catenin的激活有利于保持HSCs的活性、自我更新与增殖分化能力；而如果抑制非经典Wnt信号通路的Wnt5a，则可通过进一步抑制细胞内Cdc42等其他分子的活性蛋白活化等，并间接激活经典的Wnt3a/β-catenin，共同减缓HSCs的衰老，维持其年轻态[35]。转化生长因子β(TGF-β)信号通路由一类可以调节细胞生长和分化的多肽生长因子亚家族组成，这些家族成员的结构、功能具有一定的相关性，主要包括TGF-β、激活素、骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)等。在造血方面，TGF-β具有重要的负性调控作用，尤其是维持HSCs的静息和自我更新，一旦TGF-β表达及受体水平缺陷都可以导致造血细胞的恶性增殖，从而引发恶性血液肿瘤[36]。刘俊志等[37]发现激活Janus激酶2-信号传导子与转录激活子5(janus kinase-signal transducer and activator of transcription，JAK2-STAT5)信号通路可以促进造血生长因子白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)等的表达，从而促进造血细胞的增殖和分化，证明了JAK2-STAT5 信号通路在造血过程中也发挥了重要作用。

此外，Hedgehog、Tie2/Ang-1等信号通路也是维持HSCs正常发育和分化的重要调控因子。总之，在造血微环境中存在着大量的信号通路，他们共同维系着HSCs的稳定。而在过去几年的研究中，本课题组主要对MDSCs造血分化过程中Wnt和Notch两条信号通路的调控作用进行了初步研究。

2.3.1 Notch信号通路:Notch信号通路是一条高度保守的信号通路，影响着细胞正常形态发生的多个过程。它是一种膜蛋白受体，由Notch受体、Notch配体(DSL蛋白)及细胞内效应器分子(CSL-DNA结合蛋白)三部分组成。在哺乳动物体内主要有Jagged1、Jagged2、Delta1、Delta3和Delta4 五种配体，Notch1～Notch4四种受体以及CBF1/RBP-Jκ转录因子。Notch信号的产生是通过相邻细胞的Notch配体与受体相互作用，Notch蛋白经过连续水解，由胞内段(NICD)释放入胞质，并进入细胞核与转录因子CSL结合,形成NICD/CSL转录激活复合体，从而激活HES等基因表达，进而影响细胞的增殖、分化和凋亡。早在20世纪90年代，Notch信号通路的受体就在造血细胞中发现，且在调控造血细胞的增殖、分化和凋亡中扮演着重要的角色[38]。当Notch信号通路被阻断时，HSCs的分化率升高，从而影响了HSCs的未分化状态，提示活化Notch信号通路能抑制HSCs分化，维持其多向分化的潜能性，并进一步促进其增殖[39]。宋波等[40]运用Notch信号通路阻断剂DAPT阻断其激活，发现小鼠胚胎干细胞(Embryonic stem cell，ESCs)易于分化为造血干细胞/祖细胞(HSCs/HPCs)，且当与血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)协同使用时，该现象更加明显，证明了Notch信号通路在VEGF促ESCs分化为HSCs/HPCs中起抑制作用。

MDSCs在造血分化过程中同样受到Notch信号通路的调控作用。本课题组窦昊颖等[11-13]以不同剂量的当归补血汤对小鼠进行预处理，又通过尾静脉注射的方式将MDSCs移植到受致死剂量照射的动物模型中，研究在小鼠造血重建过程中Notch信号通路关键基因的表达情况，以及当归补血汤和MDSCs对造血重建的影响。实验结果表明，在小鼠的骨髓细胞中，Notch2、Notch3和 Notch4受体与Delta4配体受体在MDSCs向造血方向分化、增殖的过程中发挥着不同作用。其中，MDSCs 移植鼠骨髓中Notch2、Notch4和Delta4的mRNA的表达增加，Notch3的mRNA的表达减少。当加入当归补血汤时，可以促进Notch2、Notch3和Delta4的表达，但对Notch4的作用不显著。而Jagged2配体和Hes3靶基因既不参与HSCs向造血前体细胞分化过程，也不参与MDSCs向HSCs增殖、分化过程。而结果还表明，使用5倍剂量的当归补血汤协同MDSCs对造血重建的恢复效果最佳。此外，脾脏B淋巴细胞是由HSCs分化而来。他们发现，在小鼠脾脏细胞中，MDSCs 移植早期，B淋巴细胞的分化发育过程中未见Notch2和Jagged2的参与，但在MDSCs 移植晚期，Jagged2的mRNA的表达增加，对B淋巴细胞的发育过程起到了调控作用。而当使用3倍剂量的当归补血汤时可在MDSCs移植早期通过调控Notch2和Jagged2进而促进B淋巴细胞的发育。

这些研究结果均证实了Notch信号通路在MDSCs向造血方向分化的过程中发挥了重要的调控作用，而且通过经典名方当归补血汤进行干预可以促进其增殖和分化，为MDSCs的造血分化研究提供了重要的理论参考和新的研究思路。虽然课题组初步发现了Notch信号通路在MDSCs造血分化过程中的调控作用，但是MDSCs向造血方向分化具体的调控机制以及MDSCs移植入小鼠体内其归巢与转归机制仍不明晰，尚待进一步深入探究。

2.3.2 Wnt信号通路:Wnt信号传导途径是由配体蛋白质Wnt和膜蛋白受体结合激发的一组多下游通道的信号转导途径，广泛存在于无脊椎动物和脊椎动物中，是一类在物种进化过程中高度保守的信号通路，在动物胚胎的早期发育、器官形成、干细胞自我更新和分化以及肿瘤的发生发展等多种生理病理过程中，具有至关重要的作用。Wnt信号通路主要分为经典的Wnt/β-catenin信号通路、非经典Wnt/Ca2+信号通路。经典 Wnt/β-catenin信号通路由Wnt家族分泌蛋白、Frizzled家族跨膜受体蛋白Dishevelled(Dsh)、糖原合成激酶3(GSK3)、APC、Axin、β-连环蛋白(β-catenin)及TCF/LEF家族转录调节因子等构成。当Wnt分泌蛋白与Frizzled受体蛋白发生结合时，Wnt信号通路的靶基因激活，开始表达。研究表明，激活经典的Wnt/β-catenin信号通路可以上调造血细胞生成的关键转录因子和必需的特异性标志物，也能促进造血多潜能祖细胞的形成[41,42]。而非经典的Wnt/Ca2+信号通路也参与了HSCs的增殖和分化，并可能是通过与经典的Wnt/β-catenin信号通路的相互作用共同维持造血的动态平衡。

经典Wnt/β-catenin信号通路在MDSCs的分化中扮演着重要角色，参与调控MDSCs的多向分化，在造血发生和重建的过程中必不可少，而Wnt3、Wnt3a、Wnt5a和Wnt10b等是其中重要的造血基因[43,44]。课题组王丽帆等[45]构建MDSCs与BMSCs共培养体系，以当归补血汤载药血清进行干预，并分别加入Wnt信号通路激动剂和抑制剂，以研究在体外造血微环境中肌源性干细胞 Wnt/β-catenin信号通路相关基因的表达情况及当归补血汤的干预作用。结果发现，激动剂组中与造血相关的Wnt3、Wnt3a、CD34等基因、Wnt信号通路关键基因β-catenin、干细胞增殖分化关键因子C-myc以及细胞增殖因子CyclinD1的mRNA表达水平明显高于抑制剂组，表明当Wnt信号通路持续激活时，MDSCs 具有更强的增殖分化能力，显现出较强的造血潜能，且当加入当归补血汤载药血清时，该现象更明显。另外，课题组刘志强等[33]通过体外培养MDSCs，采用基因测序及PCR等技术检测Wnt信号通路中的相关基因在MDSCs增殖分化过程中的表达情况。实验结果表明，无论是MDSCs单培养组还是MDSCs与BMSCs共培养组，具有造血意义的Wnt2、Wnt3以及Wnt5a的mRNA表达量均高于新鲜分离的MDSCs组，且共培养组的mRNA表达量更具统计学意义。因此我们认为，Wnt信号通路可能参与了MDSCs的造血分化过程，但其中造血相关基因之间的相互关系仍需进一步实验探究。

3 MDSCs在造血分化过程中存在的问题

笔者通过全面的文献检索发现，国内外对于MDSCs造血功能的研究较为有限。本课题组进行了多年的研究，对其中的机制有了初步的了解，但MDSCs的造血分化并不是一个简单的过程，需要依靠众多条件的共同干预作用，而其中存在许多较为复杂的问题。比如，MDSCs向造血方向分化，不仅需要依靠造血微环境中骨髓基质细胞分泌的多种细胞因子的调节作用，也需要通过各信号通路的调控作用来维持造血分化的平衡，而我们尚未探究其中具体的骨髓基质细胞及细胞因子是如何影响MDSCs造血分化的。其次，尽管课题组初步发现了Notch和Wnt两条信号通路在造血分化过程中起到了一定的调控作用，但在这过程中两条通路是否存在串话关系以及其中具体的调控机制尚未明确，并且信号通路的调控作用可能会因实验方法的不同而产生不同甚至相反的作用。另外，造血微环境中存在多条通路，HSCs在增殖分化过程不仅受到Notch和Wnt两条信号通路的调控，还受到BMP/TGF-β、JAK2-STAT5、Hedgehog等多条信号通路的调控，那么这些通路是否也参与调控MDSCs的造血分化过程都需要我们进一步探索。

另外，我们发现模拟体外造血微环境中培养的MDSCs，仍然能向成肌细胞和成骨细胞等方向分化，显现出干细胞强大的分化特性。因此，如何提高MDSCs取材分离的纯化率、提高造血诱导培养过程中向造血细胞分化的效率，以及如何在保证MDSCs干细胞特性的前提下进行体外扩增以获得大量细胞，这些都是需要在后期实验中不断攻克的难关。此外，目前研究中尚未明晰MDSCs移植后在受体内具体的迁移、归巢途径。在今后的实验中，我们希望通过对MDSCs进行荧光标记，利用小动物活体成像技术进行示踪观察，了解其运动轨迹，以便更好的分析MDSCs的造血分化过程以及对造血功能系统的影响。

4 展望

随着医学生物学和分子生物学技术的发展，细胞治疗和基因治疗逐渐成为研究的热点，医学科研工作者通过大量的实验不断探求疾病发生发展的机制，以期找到多途径、更有效的治疗方法，攻克难治性疾病，促进人类健康。而干细胞因其强大的无限自我更新、增殖分化的能力，可通过移植到靶器官中发挥相应的作用，具有广阔的应用前景。作为成体干细胞的一种，MDSCs不仅可以治疗肌肉骨骼相关疾病，参与神经损伤修复以及糖尿病的治疗[46,47]，更因其造血分化的潜能不断得到发掘，给恶性血液病的治疗提供了新的思路。相比较HSCs移植的局限性，MDSCs具有取材容易、利于体外培养和免疫原性低等优点，如果能够在今后的研究中明确其在造血分化过程中的具体机制，即有望成为移植医学领域中新的种子细胞，为更多的血液病患者带去新的希望。