新型电荷反转型阳离子载体与BCSG1-siRNA纳米粒靶向治疗Luminal B型乳腺癌

杨琛擘，曹明卓，刘明阁，申培红

(1.郑州大学附属肿瘤医院 临床病理中心，河南 郑州 450052；2.河南中医药大学 药学系，河南 郑州 450046)

2020年美国癌症协会发布肿瘤统计报告，女性中最常见的癌症是乳腺癌、肺癌和结直肠癌，占新发病例数过半，其中乳腺癌独占新发病例数的30%[1]。Luminal B型乳腺癌是乳腺癌分子分型中最常见的亚型，占47.7%～52.8%[2-3]。Luminal B型乳腺癌发病率高，激素受体低表达，增殖指数Ki67高表达，与Luminal A型乳腺癌比较，内分泌治疗效果差、往往预后不良[4]。面对Luminal B乳腺癌高发病率和预后不良的严峻挑战，科学家和临床医生研究了多种抗击癌症的方法，如外科手术治疗、化疗、放疗，但存在副作用大、产生耐药性的问题[5-7]。因此，迫切需要开发新的、更安全、更有效和靶向性乳腺癌治疗方法，基因治疗目前在肿瘤、血友病以及失明等疾病的治疗中均取得了重大进展[8]。乳腺癌特异性基因1(breast cancer specific gene 1，BCSG1)已被证明在乳腺癌中具有特异性，是乳腺癌诊断和治疗的靶点[9]。利用RNAi技术进行基因治疗，可能达到安全高效治疗乳腺的目标。本文对BCSG1、BCSG1-siRNA和阳离子聚合物siRNA输送体系进行回顾性综述，探讨开发乳腺癌治疗的新技术。

1 Luminal B型乳腺癌概述

1.1 Luminal B型乳腺癌临床病理特征Luminal B型乳腺癌判断标准为ER阳性、PR阴性或低表达、Her2阴性、Ki67高表达。Cintra等[10]回顾性分析397例乳腺癌患者，经过免疫组化检查，40岁以下患者中Luminal B型乳腺癌比例最高，且组织学分级较Luminal A型乳腺癌高，以Ⅱ～Ⅲ级为主。研究示，与Luminal A型乳腺癌相比，Luminal B型乳腺癌发生淋巴结转移比例更高[11]。徐国萍等[12]对145例Luminal A型和Luminal B型乳腺癌进行研究，Luminal B型有39.76%患者存在腋窝淋巴结转移，高于Luminal A型(16.13%)，Luminal B型乳腺癌总体表现病情更严重。

1.2 Luminal B型乳腺癌预后较差Desmedt等[13]对831例未发生淋巴结转移乳腺癌进行分析，发现Luminal B型乳腺癌5 a内发生远处转移率是Luminal A型乳腺癌的2.86倍，提示Luminal B型乳腺癌更易发生远处转移。多项研究示，Luminal B型乳腺癌5年总生存期、无复发生存率均低于Luminal A型乳腺癌，证实Luminal B型乳腺癌预后差、复发风险高[11,14]。

2 BCSG1基因概述

2.1BCSG1基因的发现1997年，Ji等[15]通过直接差异cDNA序列分析，发现一组在人乳腺癌中高表达但在正常和良性乳腺肿瘤组织中不表达的基因，称为BCSG1。BCSG1被认为是人类突触核蛋白基因家族的新成员，与神经元突触核蛋白(synucleins，SNCs)家族中SNGG仅有4个不同核苷酸的区别，且3’端非编码区无差异，则普遍认同BCSG1与SNGG具有同源性[16]。

2.2 BCSG1的功能有丝分裂检测点机制通过一系列蛋白检测纺锤体的正确装配，以保证染色体完整复制，若蛋白受其他因素干扰或其表达基因突变，异常细胞将可能逃逸有丝分裂检测点机制，可以无障碍地通过有丝分裂期而不断增殖或产生异形的非整倍体细胞。人类细胞中有丝分裂开关激酶(BubR1)是重要的有丝分裂检测点功能蛋白之一，在人类乳腺癌组织中，BubR1的异常作用导致有丝分裂功能丧失，并使乳腺癌细胞不受限制地增殖，最终导致肿瘤发生。BubR1是BCSG1的反应蛋白，提示BCSG1可以抑制细胞有丝分裂检测点机制，促进癌细胞的不受控制的增殖[17]。Liu等[18]认为BCSG1是一种伴侣蛋白，可与多种蛋白结合形成依赖于热休克蛋白(heat shock protein，HSP)的伴侣复合物，从而促进ER阳性乳腺癌的激素反应性生长，通过免疫共沉淀证实游离ER-ɑ可与BCSG1、HSP90、HSP70结合形成复合物，并且这种结合显著增加了其配体亲和力，但这一效应可被HSP90阻滞剂逆转，这表明BCSG1对ER-ɑ配体亲和力的影响有赖HSP的参与。BCSG1与热休克蛋白共同形成复合物，ER-ɑ在复合物作用下，激活Wnt通路，β-catenin入核继而与核转录因子TCF/LEF结合，启动下游靶基因的表达，参与乳腺癌的发生发展、浸润转移。

2.3 BCSG1在乳腺癌中特异性高表达BCSG1在乳腺癌中特异高表达及其与乳腺癌进程相关性已被世界上多个独立科研单位所证实。Bruening等[19]通过蛋白质印迹分析未能在正常乳腺组织中检测到BCSG1，而82%(14/17)的Ⅲ/Ⅳ期乳腺导管癌表达BCSG1，BCSG1对于乳腺癌分期、预后和进展具有重要意义。Guo等[20]分析了438例临床乳腺标本中BCSG1蛋白表达，发现BCSG1的表达与分期、淋巴结受累、转移和肿瘤大小密切相关。中位随访64个月后，BCSG1阳性肿瘤患者的无病生存期和总生存期明显短于BCSG1不表达的患者。BCSG1是乳腺癌进展的不良预后标志，也是乳腺癌治疗的潜在靶标。Shen等[21]研究示，BCSG1在进展期乳腺癌中特异性高表达，在导管原位癌有部分表达，随着癌浸润转移程度的增加，BCSG1表达率也增加，在部分原位癌组织中BCSG1明显表达的癌组织与间质分界明显，形成不规则交界线，BCSG1灵敏度(真阳性)=76.61%；特异率(阴性)=97.50%，BCSG1特异性表达与乳腺癌进展有关，与患者的生存率呈负相关。BCSG1特异高表达与乳腺癌恶性分级和浸润程度呈正相关，BCSG1与MMP2、VEGF、CD105、Bcl2、Ki67基因呈正相关，BCSG1促进肿瘤组织血管生成，易发生淋巴结转移和远处转移，是发展新的治疗方法的新靶点[21-23]。

3 BCSG1-siRNA与乳腺癌

3.1 siRNA在RNAi分子机制中的重要作用在RNAi的初始阶段，由于转座子转录、外源基因的引入等，dsRNA出现在细胞中，特异性核酸内切酶Dicer将dsRNA裂解为21～23 nt长的siRNA。新产生的siRNA与几种关键蛋白形成沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC中的Argonaute2蛋白将siRNA解链成单链，有义链被降解，反义链与目标mRNA上的相应碱基序列配对，导致靶mRNA在相应的基因序列上被切割，3’末端序列在细胞质中被酶降解。RISC从被破坏的靶标mRNA上分离并继续切割其他靶标mRNA，最终使靶基因mRNA无法表达以抑制靶标基因[24]。

3.2 siRNA在基因治疗中的优势siRNA可以转染到细胞中并与RISC的发夹结构结合，从而启动RISC沉默基因的过程。人工合成的siRNA可以靶向目的癌基因，被引入癌细胞中特异性抑制靶基因的表达。与其他治疗技术相比，siRNA具有特异性高、效率高、稳定性和安全性高、副作用低的优点，达到了基因治疗的目标[25]。

3.3 BCSG1-siRNA治疗乳腺癌Shen等[26]构建了BCSG1-siRNA，并将其转染到人乳腺癌MCF7细胞中，发现BCSG1-siRNA特异性抑制MCF7细胞中BCSG1蛋白和mRNA的表达，用MCF7细胞建立种植瘤模型，然后将BCSG1-siRNA注射到种植瘤中，发现BCSG1-siRNA特异性抑制种植瘤中BCSG1蛋白和mRNA的表达。将BCSG1-siRNA转染到人乳腺癌细胞中，发现不仅抑制BCSG1的表达，而且干扰肿瘤的血管侵袭和转移，影响S100A4、ETS1、VEGF和CD105的表达[27]。He等[28]通过慢病毒载体向乳腺癌MDA-MB-231细胞中递送BCSG1-siRNA，发现乳腺癌细胞中BCSG1-mRNA水平明显降低，细胞迁移增殖能力明显降低，细胞周期停止。研究表明，应用BCSG1-siRNA靶向沉默BCSG1治疗乳腺癌具有理论和实验证据。

4 电荷反转型阳离子聚合物输送体系

4.1 电荷反转型阳离子聚合物具备的优势(1)高活性阳离子聚合物带有丰富的阳离子，易于与带负电荷的siRNA形成复合物，通过静电相互作用形成复合物[29]。(2)将siRNA封装到惰性纳米颗粒中以形成一个密封的环境，可以有效地防止外界因素的干扰，防止siRNA被血浆核酸酶降解。此外，通过修饰载体上的官能团，减少非特异性分布并增加血液的半衰期和靶组织中的siRNA浓度[29]。(3)避免肝脏代谢，对纳米颗粒进行一些调整，如药物蛋白质修饰。避免肾脏清除需要调节纳米颗粒的粒径和电荷，大于8 nm的纳米颗粒和更多的阴离子不易被肾脏排泄[30]。(4)由于肿瘤组织中的血管繁多、血管结构异常和淋巴引流失调，肿瘤组织具有高渗透性并截留大分子的现象，称EPR效应[31]。但在许多情况下，EPR效应对于肿瘤组织中siRNA的富集并不令人满意。利用在靶细胞表面上过表达的抗原或受体，将具有特定识别能力的配体与载体连接，设计出靶向阳离子聚合物载体[32]。(5)调节载体表面的电荷性质是保持其在血液循环中的稳定性，能够通过肿瘤内吞作用快速进入肿瘤细胞的重要方法[33]。

4.2 电荷反转型阳离子聚合物的设计与应用Qiu等[34]设计了{N- [2-(丙烯酰氧基)乙基]-N-[对乙酰氧基苯基]-N，N-二乙基氯化铵}酶响应性电荷反转载体，具有低细胞毒性和可快速释放药物的特性。Xu等[35]研究了包含PEG和PLGA的pH响应型siRNA递送聚合物(PEG-Dlinkm PLGA)，由于聚乙二醇化，包裹siRNA的PEG-Dlinkm-PLGA有效地延长血液循环并优先富集肿瘤部位。PEG-Dlinkm-PLGA在肿瘤组织的酸性微环境中作出反应，使PEG表面层脱离，促进细胞摄取，siRNA在肿瘤细胞中快速释放。Cui等[36]报道了由壳聚糖/羧甲基壳聚糖形成的双壳核结构介孔二氧化硅电荷反转阳离子聚合物，具有在不同pH环境下反转电荷的能力，能够在肿瘤组织中快速而特异性地释放药物。

5 总结与展望

面对Luminal B型乳腺癌高发病率和高死亡率，迫切需要开发新的Luminal B乳腺癌治疗策略，提高患者的生存率。BCGS1的表达与乳腺癌的恶性程度和浸润转移呈正相关，抑制BCSG1表达可有效控制乳腺癌的进程并提高治疗效果，BCSG1还增强了癌细胞在不利环境中的生存能力，使BCSG1成为治疗乳腺癌的潜在靶标。通过将BCSG1-siRNA递送至乳腺癌组织以特异性沉默BCSG1的表达，可以实现基因治疗的目标。但由于siRNA药物的稳定性差，细胞内转染率低和靶向性差，siRNA药物的临床应用受到限制。应用电荷反转型阳离子聚合物作为载体，可以有效保护siRNA避免过早降解，减少体内生物屏障对siRNA的捕获和消除。因此，利用电荷反转型阳离子聚合物搭载BCSG1-siRNA治疗乳腺癌，为乳腺癌治疗的发展提供了新的方向，有望提高乳腺癌患者生存率和生存质量。