细胞增殖在中耳胆脂瘤发病机制的研究进展

李文文 马秀岚

中国医科大学附属盛京医院耳科

中耳胆脂瘤是一种良性鳞状上皮角质化增生性病变[1]，由鳞状层状角质化上皮细胞组成，它表现为一种含有成纤维细胞和炎性细胞的表皮样囊肿[2]，由囊内容物、基质、基质外层三部分构成，囊内容物是由完全分化的无核的角化上皮组成；基质包括形成囊壁结构的角化的鳞状上皮；基质外层或固有层是胆脂瘤外周部分，由肉芽组织组成，可能包含胆固醇结晶，肉芽组织可产生蛋白水解酶。中耳胆脂瘤具有过度增殖能力，炎症可能是角质化细胞过度增殖的原因之一[3,4],伴随的是角蛋白碎片的积累和颞骨及其周围骨结构的破坏[5]。胆脂瘤除导致听力损伤和耳流脓外还可以导致多种颅内外并发症，如迷路炎、面瘫、乙状窦血栓性静脉炎、脑膜炎、脑脓肿等[6,7]，重者可能危及生命。胆脂瘤发病机制复杂，影响因素很多[7]，至今未明确。一直以来对中耳胆脂瘤机制的研究主要集中在细胞增殖，细胞凋亡等几个方面，中耳胆脂瘤的特点是细胞过度增殖，但是不像肿瘤细胞那样增殖的不受控制，而是在众多的基因、蛋白、生长因子等调控下与细胞凋亡相互作用，阻止了细胞无限增殖。如今关于细胞增殖在中耳胆脂瘤发病机制中的作用备受关注。本文对细胞增殖在中耳胆脂瘤发病机制中的作用进行综述。

1 Ki-67与细胞增殖

Ki-67核抗原是细胞增殖的标志物，表达于细胞周期的所有活性阶段(G1、S、G2、M)，而不表达于细胞周期的非活性阶段(G0)。Ki-67负责细胞分裂过程中染色体的耦合、稳定以及核蛋白对称分布的保护与调控[8]。根据Ki-67在细胞核、核仁或核浆的不同位置，其被分为粒状、弥漫性或混合性细胞型。Ki-67具有特异性的免疫反应，可在获得性胆脂瘤基底和基底上层检测到，而Ki-67仅出现在正常皮肤上皮的基底层。Erdoglija[9]等应用免疫组化法对50例胆脂瘤检测，发现Ki-67在胆脂瘤中的表达高于外耳道皮肤和耳后区皮肤。增殖的角质形成细胞数量增多，在基底和基底上层均可检测到。角化细胞标志物Ki-67在细胞周期的所有活性阶段均有表达。胆脂瘤的高增殖能力与其侵袭模式相关。Mahmood[10]等在研究中发现Ki-67在胆脂瘤组织中过表达，与骨吸收活性呈正相关。Ki-67可以预测胆脂瘤的侵袭性。

2 KGF/KGFR与细胞增殖

角质细胞生长因子（KGF）是成纤维细胞生长因子(FGF)家族的独特成员，主要由基质中的成纤维细胞分泌，KGF与其受体(KGFR)结合导致KGFR形成二聚体，激活细胞内激酶域，从而使KGFR磷酸化。通过受体KGFR作用于皮肤中的上皮细胞，在调节细胞增殖，分化，迁移等生命活动中起重要作用。成纤维细胞生长因子受体底物2(FRS2)被KGFR磷酸化，进而形成蛋白复合体，而后激活Ras/Raf/MAPK通路和PI3K/Akt通路，导致细胞增殖和存活[11,12]。Xie[13]等在研究中发现KGF/KGFR胆脂瘤中的表达与复发之间存在显著的正相关关系，提示KGF/KGFR信号通路可能参与了胆脂瘤上皮细胞高增殖活性和胆脂瘤复发。Yamamoto-Fukuda[14]等研究发现KGF过表达可能增加干细胞/祖细胞增殖，阻断终末分化，导致上皮增生，这是中耳胆脂瘤的典型表现。Harabagiu[15]等在研究中发现胆脂瘤上皮细胞的异常行为似乎是由KGF和KGFR的旁分泌相互作用所致。KGF和KGFR的胆脂瘤在胆脂瘤中表达增高，这与其侵袭性有关。结果提示，过量的KGF和KGFR合成可能导致胆脂瘤的高增殖状态，可以解释胆脂瘤与慢性化脓性中耳炎的病理差异。

3 microRNA与细胞增殖

microRNA是mRNA转录后控制基因表达水平的重要因素。各种生物过程，例如生长和分化，都受到microRNA的调控。microRNA已被证明在听力损失的发展中发挥着重要作用。目前，microRNA被认为是参与不同生理、生物和病理过程的关键因素，如基因表达、进行性感音神经性听力损失、年龄相关性听力损失、噪声性听力损失、胆脂瘤、神经鞘瘤、内耳炎症等。Zhang[16]等收集23例中耳胆脂瘤，提取培养中耳胆脂瘤角质细胞，研究中发现miRNA Let-7a通过两种不同的机制抑制胆脂瘤角质形成细胞的生长:在G0/G1期促进细胞周期阻滞，抑制角质形成细胞的增殖，诱导细胞凋亡。miRNAlet-7a除了抑制细胞生长外，还抑制胆脂瘤角质形成细胞的迁移和侵袭。miRNAlet-7a可能通过调节miR-21及其靶点来控制细胞增殖和凋亡。研究显示miRNAlet-7a下调miR-21的表达，抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡。miR-21可负性调控其靶基因PTEN和PDCD4的表达，促进胆脂瘤的增殖和入侵角质细胞。Zang[17]等研究发现miR-203a在胆脂瘤中下调，同时Bmi1上调，Bmi1是miR-203a的直接靶基因。沉默miR-203a可增加Bmi1表达;促进HaCaT细胞的增殖、集落形成和迁移;和抑制细胞凋亡。结果显示miR-203a可能通过靶向Bmi1调控胆脂瘤的生长和增殖。这些发现为胆脂瘤的非手术治疗提供了新的选择。

4 中耳负压与细胞增殖

中耳有两个压力调节系统:咽鼓管和中耳粘膜的气体交换。咽鼓管或者中耳粘膜任何一个的功能障碍均可导致中耳持续负压。中耳负压可能是中耳慢性疾病发展的重要致病因素之一，如鼓膜萎缩、持续性中耳积液、粘连性中耳炎、中耳胆脂瘤等。特别是单纯慢性咽鼓管阻塞所致中耳较高的负压，被认为与内陷袋性胆脂瘤的病因及术后复发密切相关。Friedmann[18]讨论了外耳道鳞状上皮细胞(EAC)可能迁移到中耳形成胆脂瘤。机械力是细胞骨架和分子重组中的重要因素[19,20]。有趣的是，在肺上皮细胞中，已经认识到机械变形会影响上皮细胞的周转和细胞骨架的重塑[19]。Naotaro[21]等在在大鼠中耳形成负压模型，研究中发现中耳持续负压可能会加速鼓膜上皮细胞的增殖和分化，负压下全耳鼓膜松弛部收缩。组织学分析显示鼓膜松弛部上皮增厚。该区域细胞角蛋白5（ck-5）阳性细胞和细胞角蛋白10（ck-10）阳性细胞层厚度增加。结果显示中耳持续负压可使鼓膜松弛部上皮增厚，促进上皮细胞增殖和分化。

5 EGFR/AKT/NF KappaB/cyclinD1与细胞增殖

表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)在表皮细胞、成纤维细胞和角质形成细胞的正常增殖中发挥着重要的生理作用。然而，在许多涉及异常增殖的病理条件下，EGF的表达水平被上调。EGF调节胆脂瘤的增殖可能通过两条途径，一是通过旁分泌调节胆脂瘤上皮下的炎症细胞，二是通过自分泌调节胆脂瘤上皮的角化细胞。EGF受体(EGFR)是ErbB家族的酪氨酸激酶受体，是一种170 kDa的糖蛋白，由细胞内、细胞外和跨膜结构域[21]组成。EGF与EGFR结合形成二聚体，随后通过细胞内结构域磷酸化而活化，从而启动磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt信号通路[22]。Akt又称蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)，是一种丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶，在脑、心、肺、皮肤等多种人体组织的细胞生长和增殖的正常调节中发挥着关键作用。据推测，在正常的细胞周期中，Akt的调节得到了很好的控制。相反，在增生性疾病中，很可能存在调节失调，磷酸化Akt可以通过激活转录因子NF kappaB和下调cyclinD1从而促进细胞增殖[23]，EGF、TGF-α和AR，是重要的生长因子，对表皮正常的增殖细胞,成纤维细胞和角质细胞等起重要作用。这些配体结合,通过自身磷酸化激活表皮生长因子受体,从而激活细胞内激酶级联的PI3K/Akt/NF-κB cyclinD1途径[22]，Liu[24]等在研究中发现p-EGFR、p-Akt、NF kappaB、cyclinD1分别在胆脂瘤中的表达高于外耳道皮肤，斯皮尔曼相关分析显示p-EGFR和p-Akt为正相关，p-Akt和NF kappaB为正相关，NF kappaB和cyclinD1为正相关，结果显示EGFR/AKT/NF KappaB/cyclinD1可能参与了胆脂瘤上皮细胞增生机制。此研究结果与王晓丽[25]研究结果一致。

6 KRT基因与细胞增殖

KRT（细胞角蛋白基因）是存在于上皮起源细胞中的IF超家族成员，通常以高度调控、组织特异性、细胞周期阶段和分化依赖性的方式表达。因此，细胞角蛋白常作为上皮细胞迁移、分化和增殖状态的标志物。角蛋白和其他蛋白质之间的相互作用诱导细胞内信号传递，调节细胞迁移、侵袭和转移。在恶性上皮细胞中发现了几种不同表达的细胞角蛋白，其特异性表达模式往往与某些肿瘤的预后和转移潜能相关，如乳腺癌和口腔肿瘤[26]。KRT1与KRT10在表皮基底上共表达，KRT1/KRT10复合物表达升高，提示角质形成细胞终末分化增加。KRT19特异性表达于发育中的表皮的外周。虽然KRT19是肿瘤细胞检测最常用的标记物之一，但最近的研究结果表明，KRT19是一种潜在的肿瘤抑制因子。它通过调节Egr1核定位负调控Akt信号。下来调节通过促进细胞增殖和迁移的核易位β-catenin从而调制NUMB-dependent NOTCH信号通路[27]。胆脂瘤高增殖表型的背景下存在大量的细胞角蛋白[28]。Enikő Palkó[29]等对获得性胆脂瘤26例进行研究发现，KRT1和KRT10基因虽然位于不同的染色体上但是在角质形成细胞终末分化过程中他们协同表达，IF形成时他们的蛋白产物形成功能二聚体。结果显示KRT1和KRT10的表达模式相同，儿童病例中KRT1和KRT10的表达高于成人，尤其是在儿童复发样本中。KRT19的表达水平与KRT1/KRT10的表达水平成反比，在儿童和成人侵袭性较强的复发病例中表达水平均较低。

7 未来与展望

胆脂瘤发病机制复杂，至今对其的探究从未止步，其治疗方法单一，临床上主要依靠手术治疗，但是并不能防止其复发，据报道5年的胆脂瘤残留率和复发率分别为20.6%和5.1%[30]。对于胆脂瘤的研究最终的目的是希望能达到预防，治疗，防止复发等一系列从根本上解决胆脂瘤对患者带来的痛苦的措施。既往研究表明，5-FU乳膏局部应用2-5次，间隔2周，经KGF信号通路可明显降低胆脂瘤角质形成细胞的增殖活性[31]。与对照组相比，5-FU组Ki-67标记指数明显降低(5-FU组为37.5±0.2%，对照组为49.5±0.2%)，提示对早期胆脂瘤有良好的药物治疗前景。EGFR抑制剂AG1478完全抑制了表皮生长激素诱导的角质形成细胞增殖，表皮生长激素中和抗体和siRNA-表皮生长激素可显著降低角质形成细胞与胆脂瘤成纤维细胞共培养的集落形成效率[32]，推测抗表皮生长激素有希望对胆脂瘤起治疗作用。探索分子信号通路有助于拓宽治疗选择的范围，开发非侵入性治疗方法，确定抑制上皮细胞过度增殖的某些关键靶向分子，以防止获得性胆脂瘤的发生、发展和复发[33,34]。种种研究表明，有望从细胞增殖的角度出发，针对于有关细胞增殖的信号通路、蛋白、基因等各方面对胆脂瘤进行非侵入性治疗。