生物样本库建设过程中生物安全和生物危害指导文件——了解生物安全等级，满足生物样本库安全要求

刘妍，张小燕，林爱芬 编译，胡迅 审校

·新型冠状病毒专栏·

生物样本库建设过程中生物安全和生物危害指导文件——了解生物安全等级，满足生物样本库安全要求

刘妍，张小燕，林爱芬 编译，胡迅 审校

100039 北京，解放军总医院第五医学中心临床研究管理中心（刘妍）；201210 上海，生物芯片上海国家工程研究中心（张小燕）；317000 台州，浙江省台州医院生物资源中心（林爱芬）；610041 成都，四川大学华西医院生物样本库（胡迅）

当生物样本库处理不同类型的实验室样本时，能及时了解潜在的生物危害，以确保操作员和实验室人员的安全十分重要。生物安全等级（BSL）是一系列用于通知实验室人员有关实验室环境中生物危害风险等级的名称。根据疾病控制和预防中心（CDC）的规定[微生物和生物医学实验室的生物安全，第 5 版，HHS 出版号（CDC）21-1112]，按照风险增加的顺序，共有四个级别。本文将重点探讨这些等级之间的主要区别，包括简要介绍对生物危害物质进行分类的危害特征，并定义满足安全要求的要点。

生物安全； 安全要求； 生物危害； 生物安全等级； 个人防护装备

1 前言

生物安全等级（biological safety levels，BSL）是一系列安全预防措施，可帮助降低实验室人员接触潜在传染性生物危害物的风险。CDC 定义并付诸四个生物安全等级的实施。每个 BSL 都有具体的控制措施，包括微生物操作、安全设备和设施防护措施，以保护实验室工作人员、公众和环境免受实验室使用的传染性生物危害物的影响。随着风险等级的提高，这些遏制措施以金字塔状的方式建立在前一种安全等级上。BSL 决定了在实验室环境中允许开展的工作类型，并且在设施的设计中发挥着巨大作用。

1.1 生物危害物质风险评估

风险评估在确定实验室的 BSL 方面起着重要作。CDC 将风险评估定义为一种合理的针对生物危害物的安全操作过程，即采取适当的措施以防止其造成实验室相关的感染发生。风险评估主要考虑两大类：生物物质的风险和实验室操作流程的风险。同样，BSL 的主要决定因素取决于实验室程序以及所使用的生物物质。在风险评估过程中，主要考虑以下参数：①感染性：病原体建立感染的能力或病原体的水平传播能力；②传播能力；③进行的工作性质。

具体而言，在对实验室处理的生物危害物进行风险评估时，要仔细检查这种物质的主要危险特性。包括：①在易感的人或动物宿主中感染并引起疾病的能力；②通过所致疾病的严重程度来衡量毒力；③是否具有有效的预防措施和治疗方法；④危险物质的其他特征包括实验室感染的传播途径、感染剂量及其在环境中的稳定性、宿主范围和流行特性。

综上因素都有助于相应危险物质的风险评估。世界卫生组织（WHO）已为生物医学环境中使用的有害物质建立了风险组别分类[1]。这些危险物质主要根据自然疾病的传播途径分为不同的层级。值得注意的是，这 4 个风险组别分类不等于在实验室环境中实施的 BSL。

2 生物安全等级区别

CDC 设定了 4 个 BSL，它们构成了在这些实验设施中进行生物危害交流和培训工作的重要组成部分。大多数机构都设有生物安全审查委员会，以确保这些准则能很好地遵守，并且通常能解决实验室特定的问题。涉及人体样本的临床工作通常在 BSL2 指南下进行，尽管通常并不知道这些临床样本的传染性。当处理含血液或血液痕迹的样本时，BSL2 的合规水平与职业安全与健康管理局（OSHA）（执行安全与健康立法的监督机构）标准非常吻合[2]。严格遵守 CDC 给出的准则和建议将有助于沟通以产生更安全的工作空间，并促进实验室的合规性。本文介绍了标准实验室中的生物安全等级的区别和分类，但没有涉及针对脊椎动物生物安全等级标准提供的特定指南。CDC 在微生物学和生物医学实验室的生物安全[3]中提供了对生物安全等级、安全性实践以及动物生物安全性等级监管标准的全面而深入的探讨。

2.1 生物安全等级 1

生物安全等级 1（BSL1）是最低的风险等级，主要的工作和程序涉及的是已建立的特征性的微生物菌株，尚未知它们可否持续地在健康成年人中引起疾病。这些微生物通常对环境的威胁也最小。例如：枯草芽孢杆菌、尾刺耐格里原虫、酿酒酵母和大肠杆菌。在 BSL1 实验室的研究通常在开放的实验室工作台上进行，而无需特殊的防护。CDC 建议遵循以下标准微生物实践。

2.1.1 BSL1的程序和实践

1．在工作/处理有潜在危险的材料之后以及离开实验室之前，必须要洗手。

2．禁止在实验室区域饮食、吸烟、戴隐形眼镜、化妆和存放食物。实验室中使用的冰箱和冰柜必须清楚地标明仅供实验室使用。

3．禁止用口吸法移液。

4．建议减少尖锐物的使用，例如巴斯德玻璃移液器、针头和手术刀，包括实施工程控制措施和正确使用尖头针头（用过的针头不要套回针帽，须弃于防刺穿的容器中等）。

5．尽可能减少飞溅物和气溶胶的产生。

6．接触微生物/其他 BSL1 指定试剂后要对工作台表面进行消毒处理。

2.1.2 BSL1 的安全设备

BSL1 实验室不需要像生物安全柜这种特殊设备。以下是在 BSL1 使用的主要屏障和个人防护设备：

1．建议使用一般的实验室外套。

2．进行可能会产生气溶胶和危险物质飞溅的程序时，需要使用防护眼镜。

3．处理危险或潜在危险的材料时，应戴手套以防止手暴露。如果手套被污染或刺穿，则应及时更换。手套不能重复使用，并且在实验室人员对乳胶过敏的情况下，应提供乳胶手套的替代品。离开实验室之前，要求必须洗手。

2.1.3 BSL1 的实验室设施

1．洗手池。

2．可以将工作区与其余设施分隔开的门，并有门禁控制出入。

3．实验台应防水且耐热、耐有机溶剂和酸碱。

4．实验室工作用椅应使用无孔防渗且易于消毒及除污的材质。

2.2 生物安全等级 2

生物安全等级 2（BSL2）建立在 BSL1 的安全预防措施和工作程序的基础上。BSL2 类的生物有害物质会对环境造成中等危害，如果实验室人员因不慎皮肤接触、吸入或食入也会导致中等危害。BSL2 有害物质包括金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和人类细胞系等。BSL2 实验室与 BSL1 实验室的区别在于，增加了专门针对处理 BSL2 病原体的特定培训。这些实验室对进入工作区有限制，BSL2 有害物质的处理、使用和操作都在工作区里进行。最后，所有可能产生传染性或可能产生传染性气溶胶/飞溅物的操作均要在生物安全柜（BSC）中进行。

2.2.1 BSL2的程序和实践

1．在使用 BSL2 危险物质时，应有严格的实验室门禁。

2．进入实验室的每个人都应该看到有关潜在危险的警告标志。

3．应对实验室人员进行操作 BSL2 危险物质的相关培训。

4．应为实验室人员提供所操作感染物相关的免疫接种。

5．必须准备一份易于操作、实施的实验室专用生物安全手册。

6．在采集、处理、加工、存储和转运的整个过程中，应将传染性和潜在传染性材料放入耐用的防漏容器中。

7．有危险物溢出或飞溅后，应定时对实验室设备进行消毒。

8．当涉及感染性物质的泄漏时，应由经过专业培训的人员来控制和消毒。

9．任何情况下，暴露于感染源的设备在移出实验室之前都要进行清洁和消毒。

10．有关 BSL2 感染物处理和操作的程序都应在生物安全柜或其他物理防护装置中进行。

11．与实验室工作无关的动植物严禁进入实验室。

2.2.2 BSL2 的安全设备

BSL2 实验室含有用于 BSL1 实验室的所有安全设备和预防措施。这包括所有工程控制、安全设备和任何特殊的实验室设施。以下是 BSL2 实验室中使用的主要屏障和个人防护设备列表。

1．对于可能产生传染性气溶胶的操作，包括对装有传染性材料的开放容器进行移液、离心、研磨、混合、摇动、超声处理或常规处理，必须使用特殊的防护设备，如生物安全柜。

2．在使用危险材料时，必须始终穿戴实验室防护服和工作服，并且在离开实验室之前必须脱掉防护服。

3．应使用眼睛和面部防护设备（即护目镜、面罩、口罩）来防止任何可能的飞溅、喷雾和其他可能的危险暴露。

2.2.3 BSL2的实验室设施

1．实验室门应可自动关闭并设有门禁，仅授权的工作人员可出入。

2．实验室的设计应便于清洁和消毒。

3．地面应防滑，不得铺设地毯等。

4．不建议窗户向外开启。但如果存在，则应安装纱网并密封。

5．应将生物安全柜安装在适当的位置，以免干扰房间的空气供应和排气，并与实验室的门和人员密集处保持足够的距离。

6．生物安全柜应该每年进行认证。来自 II 级 BSC 的高效微粒空气过滤器（HEPA）排出的空气可以安全地再循环回到实验室。

7．洗眼站应随时可用。

8．高压灭菌设施或其他实验室废物净化的装置（如焚烧炉）应备好且便于使用。

9．真空管路应上底漆，并用液体消毒剂保护。

2.3 生物安全等级 3

生物安全等级 3（BSL3）建立在 BSL1 和 BSL2 的安全预防措施和程序的基础上。包括所有工程控制、安全设备和任何特殊的实验室设施。BSL3 类的生物危害物质是本土的或外来的，可通过呼吸道传播导致严重或致命的疾病。例如结核分枝杆菌、SARS 冠状病毒、鹦鹉热衣原体等。BSL3 实验室与 BSL2 实验室的区别在于危险物质的传播性质。BSL3 实验室还要求增加负压定向气流的预防措施，以确保空气从非实验室区域流入实验室区域。

2.3.1 BSL3 程序和实践

1．实验室人员必须接受有关 BSL3 危险物质（具有潜在的致命性）处理和操作的专门培训。

2．所有涉及此类危险物质的处理操作步骤都必须在生物安全柜或其他物理密闭设备中进行。

3．需要送出实验室外消毒的危险物质，应在防漏、安全和耐用的容器中转运。

4．必须在实验室入口的门上清楚地标识通用的生物危害标志。

5．在接触传染性物质后必须立即评估，流程必须遵循实验室生物安全手册。必须将所有突发事件报告给实验室主管，并保留实验室记录。

2.3.2 BSL3 安全设备

1．在 BSL3 实验室中进行的所有涉及感染性物质的操作，都必须使用 II/III 级生物安全柜。

2．人员防护设备（PPE）包括防护服，配以有系带的实验室工作服或包裹罩衫或连体工作服。BSL3 实验室中穿戴的 PPE 任何时候都不得在实验室外穿戴。某些 BSL3 PPE 可以重复使用，但在送洗之前必须进行消毒。

3．在装有感染性动物的房间中，必须使用护目镜、面罩和呼吸防护装置。

2.3.3 BSL3 的实验室设施

1．进出实验室仅限于经过授权和培训的人员。

2．BSL3 实验室必须通过两个独立的自动关闭和锁门系统进入。建议在两个自动关闭门之间的通道中放置一个缓冲前厅，在该处可以换衣服并适当整理个人防护装备。

3．实验室设计时必须考虑最少水平占地，便于清洁和消毒。

4．地板、墙壁、天花板、门、通风口和表面的所有缝隙均应密封。

5．天花板和墙壁的表面应光洁，所有表面均应易于清洁和消毒。

6．地板必须防滑、防水并且耐化学腐蚀。应考虑安装无缝、密封、具有弹性的地板。

7．若对实验室空间进行翻新、维护、关闭或任何其他重大改变，必须对整个实验室进行消毒。

8．除疏水阀中的液体消毒剂外，所有真空管路还必须使用 HEPA 过滤器进行保护。

9．BSL3 实验室必须具有管道通风系统，该系统通过将空气从清洁区域抽入实验室并将其移向可能受到污染的区域，从而提供持续的定向气流。该空间的设计应确保在出现故障的情况下气流不会反向。需要记住有关通风系统的一些提示：

（a）实验室人员应能够轻松识别气流方向。

（b）应在实验室入口处放置一个指示气流方向的可见监控装置。最好使用声音警报来通知气流中断。

（c）实验室排气不应再循环至建筑物的任何其他区域。

10．HEPA 过滤器外罩应具有气密性隔离风门，消毒端口和（或）袋装入/袋装出功能（具有适当的消毒程序）。应对每个过滤器和外罩进行泄漏测试，且有年度检测和认证。

11．只有经过每年重新认证和测试并遵从厂商建议而使用的 HEPA 才合格，来自 II 级 BSC 的 HEPA 过滤后的废气才能安全地再循环到实验室环境中。BSC 可以通过硬连接直接排到室外，也可以连接到实验室的排风系统。

12．III 类 BSC 必须硬连接到机柜的第二个排气 HEPA 过滤器。

13．必须保持 BSC 的供气，以保持安全柜的负压。

14．含有 HEPA 过滤功能的密闭装置（即 BSC）将用作可能产生传染性气溶胶的设备的主要屏障装置。HEPA 过滤器必须每年进行测试和更换。

15．根据 BSL3 实验室的风险评估，可能需要实验室增强功能。包括：用于清洁存储设备、物资用品和衣着入出、淋浴功能的前厅；用于实验室隔离的气密风门；除已在安全外罩设备上安装的 HEPA 过滤器外，还需对实验室废气进行 HEPA 终端过滤；实验室废水消毒；高级访问控制设备（即生物认证）。

16．设施设计、操作程序和参数必须在 BSL3 实验室全面运行之前记录在案。每年须对整个设施进行重新评估和记录。

2.4 生物安全等级 4

生物安全等级 4（BSL4）是非常罕见的生物安全最高级别实验室，通常是独立的设施，与其他设施在物理上是非连接的，且充分隔离。BSL4 是建立在 BSL1、2 和 3 实验室的安全预防措施和程序的基础上，包括所有工程控制、安全设备和特殊的实验室设施。BSL4 类生物危害物质具有危险性和奇特性，在实验室中通过气溶胶/呼吸道传播构成高风险，可能导致威胁生命的疾病，且通常没有疫苗和治疗方法。BSL4 处理的是某些传播途径仍不清楚的有害微生物，包括埃博拉病毒、马尔堡病毒和拉沙病毒以及克里米亚-刚果出血热等。

BSL4 实验室与 BSL3 实验室的不同之处在于，实验室人员和工作人员在处理极危险的传染源时需要进行专门的培训。包括一级和二级安全措施，以及涉及处理、操作和存储这些极危险物质的所有标准和特殊做法。BSL4 实验室分为柜式实验室和防护服实验室两种类型，两者之间的差异以及针对 BSL4 的附加保护措施将在下面详细讨论。

2.4.1 BSL4 程序和实践

1．只有出于科学研究或受到其他必要支持为目的的人员才有权进入 BSL4 实验室。

2．所有进入 BSL4 实验室的细节都必须正确记录，包括日期、时间和所有进出实验室人员的姓名。

3．实验室人员在进入 BSL4 实验室之前必须更衣。

4．实验室人员在离开 BSL4 实验室之前必须淋浴。

5．除非有紧急情况，否则实验室的人员出入必须通过专门的更衣室。

6．用过的实验服必须作为污染材料处理，并且不得通过个人淋浴设备从内部更衣室移走。在送洗之前，应对它们进行彻底消毒。

7．所有从 BSL4 实验室运出的材料都必须彻底消毒。

8．实验室主管对实验室人员的监督至关重要，其中包括要确保实验室人员做到：

（a）接受有关 BSL4 设施的特定操作和各个 BSL4 设施相关操作步骤的相关培训。

（b）在 BSL4 密闭空间处理致病微生物时，能熟练掌握标准和特殊操作。

（c）接受必要的年度更新培训，并在流程或制度有任何变化时要确保接受额外的培训。

9．从实验室中取出的生物材料必须在不易破损的密封主容器（一层包装）中转移，然后再密封在不易破损的密封二级容器中（二层包装）。这些材料必须通过消毒罐（三级包装）、熏蒸室或消毒淋浴器消毒后转移。从实验室中取出的包装材料必须保持活力和完好无损，并且除非经过确认的方法灭活，否则不得在 BSL4 密闭容器之外打开。

10．未通过更衣室带入 BSL4 实验室的耗材、设备和材料，必须通过先前已消毒的双门高压灭菌器、熏蒸室或气闸带入。锁紧外门确保安全后，实验室内的人员可以通过打开高压灭菌器、熏蒸室或气闸的内门来取回材料。熏蒸室或高压灭菌器的门必须以防止外门打开的方式锁定，除非高压灭菌器或熏蒸室已完成净化循环。

11．BSL4 实验室内应仅存放必要的设备和耗材。

12．必须制定紧急程序和规程，包括医疗急救、设施故障、逃走的动物和其他紧急情况。必须向所有实验室人员提供紧急操作流程培训。

2.4.2 BSL4 安全设备

柜式实验室：实验室中涉及感染材料的所有工作必须在 III 级 BSC 中进行。III 级 BSC 特殊流程包括：

（a）从 III 级 BSC 中排出的污染物质必须要通过双门高压灭菌器。高压灭菌器门必须联锁（类似孔明锁），以便在任何指定时间只能打开一个门，并对其进行自动控制，以便在彻底完成消毒循环后方可打开外部高压灭菌器门。

（b）III 级 BSC 必须通过消毒罐、熏蒸室或等效的方法进行消毒，以便将不能被高压灭菌器消毒的材料和设备安全地从柜中移出。污染物质的外包装物必须全程保持不受损。

（c）必须将 HEPA 过滤器放置在进气口上，并将两个 HEPA 过滤器串联在设备的排气口上。机柜的供气和排气管道上必须有气密阻尼器，以允许对设备进行气体或蒸汽净化。所有 HEPA 过滤器外壳上都必须设有用于注入测试介质的端口。

（d）BSC 内部必须具有光滑表面，以便于清洁和消毒；必须消除所有锋利的边缘，以减少割伤和手套撕裂的风险。BSC 中的所有设备也不应带锋利的边缘。

（e）必须在使用前检查 III 类机柜手套，如有损坏，应及时更换。机柜在每年重新认证后，应同时更换手套。

（f）个人衣物、首饰或其他物品不得通过淋浴区以外的 BSL4 空间，但眼镜除外。

（g）机柜手套下方须存放一次性手套，以增加保护。手套严禁带出实验室外。

防护服实验室：在 BSL4 防护服实验室中进行的所有工作必须在一件连体式正压供气式防护服中进行。

（a）必须在经过 HEPA 过滤的主要屏障系统（即 BSC）内进行所有传染性微生物的操作和处理。来自 II 级BSC 的 HEPA 滤过的空气可以安全地再循环回到实验室空间。

（b）实验室人员在进入室内穿戴正压服之前，必须穿着实验室防护服，如磨砂服。

（c）必须戴一次性手套，以防防护服手套破损。请勿在更衣区域外佩戴一次性手套。

（d）在实验室操作期间，要对防护服手套进行消毒处理。

2.4.3 BSL4的实验室设施

柜式实验室设施要求：

（a）BSL4 柜式实验室通常位于单独的建筑物中或在建筑物的一个隔离限制区。

（b）实验室必须有专用的供气和排气，以及真空管路和指定的消毒系统。

（c）设施中的房间必须顺序布置，离开 BSL4 设施之前的实验员有序地从污染的更衣区到个人淋浴间，最后进入洁净的更衣室。

（d）设施应具有自动启动的应急电源，以在紧急情况下调控生命支持系统、警报、实验室排气系统、照明、进出控制、BSCs 和其他门密封垫圈。

（e）BSL4 设施要求在密闭罩上装有双门高压灭菌器、熏蒸室、储罐或通风气闸，以便于传递物品或设备。

（f）机柜室、内部更衣室和外部更衣室的门旁必须有医用感应式洗手池。装有 III 级 BSC 的房间中的所有水槽必须连接到废水净化系统。

（g）实验室地板的排水管必须直接连接到废液消毒系统。

（h）穿透实验室墙壁、地板或天花板的管道安装或任何其他施工，必须做到密封以确保实验室没有回流。环境通风系统必须有两个串联的 HEPA 过滤器，并密封到第二个过滤器。

（i）窗户必须是防裂碎和密封的。

（j）不建议使用中央抽真空系统，但如果已使用了这样的系统，则除用于机柜的房间外，不得将其用于其他任何区域。

（k）该设施应具有专用的非循环通风系统，并且此类HVAC 系统只能在 BSL4 相同级别实验室之间共享。实验室内必须保持相对周围环境呈负压。

（l）必须有多个排气风扇。建议安装多个供气风扇，且供气风扇和排气风扇必须联锁，以防止实验室正压。

（m）应使用具有警报功能的设备监视设施的通风系统，以防系统故障。

（n）所有供给机柜的气体和由 BSL4 外排的气体必须经过两个 HEPA 过滤器。

（o）必须提供熏蒸室、储罐或等效的消毒方法，以便将不能在高压灭菌器中消毒的材料和设备安全地从机柜室中移出。

（p）来自机柜室内地漏、水槽和机柜内高压灭菌室的液体废物必须经过消毒处理，最好进行加热处理，然后再排入下水道。淋浴和厕所产生的液体废物无需处理。

（q）在实验室外打开的高压灭菌器必须用耐用、气密且能够伸缩的生物材料密封。从高压灭菌器室排出的气体也必须进行消毒处理。

（r）必须对机柜 BSL4 设施进行年检，对运行参数进行测试和验证。

防护服实验室设施要求：与柜式实验室具有相同的要求，还包括以下附加规定：

（a）BSL4 防护服实验室通常位于单独的建筑物中或建筑物中的一个隔离区域中。

（b）必须布置排列好设施内的房间，以确保气流定向通过化学淋浴间、内部更衣室、个人淋浴间以及最后的外部洁净更衣区域。

（c）必须通过装有气密门的气闸才能进入 BSL4。

（d）在实验员离开实验室之前，需要使用化学喷淋对正压防护服的表面进行消毒。一旦需要紧急出口，或者如果化学淋浴系统发生故障，则需要无压供给化学消毒剂进行消毒。

[1] World Health Organization. Laboratory biosafety manual. 3rd ed. Malta: 2004. [2016-01-02]. http://www.who.int/csr/resources/ publications/biosafety/Biosafety7.pdf?ua=1.

[2] United Stated Department of Labor. Bloodborne pathogens. Occupational safety and health standards. (2012-04-03) [2016-01-02]. https://www.osha.gov/pls/oshaweb/owadisp.show_document?p_table=STANDARDS&p_id=10051.

[3] Centers for Disease Control and Prevention. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories, 5th ed. (2018-10-24) [2016-01-02]. https://www.cdc.gov/labs/BMBL.html?CDC_AA_refVal =https%3A%2F%2Fwww.cdc.gov%2Fbiosafety%2Fpublications%2Fbmbl5%2Findex.htm.

胡迅，Email：hxxhu99@163.com

2020-03-11

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.02.009