2019 年石家庄市栾城区奶牛“两病”监测分析

刘莹，张涛，程丽华，边青岩，石兴亚，左玉柱，路广计，范京惠

（1.河北农业大学动物医学院； 2.河北省动物疫病预防控制中心；3. 河北省饶阳县农业农村局；4.石家庄市动物疫病预防控制中心）

河北省现代农业产业技术体系专栏

布鲁氏菌病和结核病（以下简称“两病”）是危害奶牛健康的主要传染病之一， 已被世界卫生组织（OIE）列为必须报告的动物疫病，在我国被列为二类动物疫病， 并且一直受到密切关注。 布病的主要传播途径有消化道、呼吸道、皮肤黏膜以及生殖系统传播， 其受侵害最为严重的是生殖系统， 严重影响生殖功能。 不仅给养殖业造成巨大的经济损失，也危害人类的健康。牛结核病在我国《动物防疫法》中被列为二类动物疫病， 开放性结核病牛是传染源的主要组成部分， 呼吸道和消化道为主要传播途径， 由于我国奶牛养殖产业的进一步扩大且散养较多， 导致我国奶牛跨区域交易日益频繁，不能得到有效地控制，致使我国畜牧养殖遭受巨大的经济损失，甚至危害人类健康， 威胁人类公共卫生安全。

随着畜牧养殖的迅猛发展，奶牛养殖数量不断增加， 社会公共卫生问题日趋严重。因此，本研究主要对石家庄市栾城区奶牛场2019 年牛布鲁氏菌病和牛结核病的发病情况进行监测， 通过不同的检测方法对“两病”进行监测并对监测数据进行整理及分析，加强奶牛“两病”的普查、监测和防疫工作，对控制“两病”的扩散、保证养殖业经济效益及人类生命健康安全有着至关重要的作用。

1 材料与方法

1.1 受检奶牛

2019 年石家庄市栾城区某奶牛场存栏奶牛，共计检测315 头。

1.2 主要试剂

虎 红 平 板 凝 聚 （ 批 号：01001190）购自青岛立见公司；牛型结核菌素（批号：1824718）、禽型结核菌素 （批号：1804896）、 牛结核IFN-γ- ELISA 检测试剂盒均购自青岛瑞尔公司。

1.3 检测方法

1.3.1 布鲁氏菌病按 照（GB/T18646-2002）国 家《动物布鲁氏菌病诊断技术》进行操作及判定。首先进行血清学鉴定，将采集的牛血清用虎红平板凝集试验进行初次筛选， 阳性者再用试管凝集试验进行第二次检测， 统计并分析监测数据。

1.3.2 牛结核病

按 照（GB/T18646-2002）国 家《奶牛结核病诊断技术》标准执行及判定。 同时采用皮内变态反应试验（TST）、 比 较 皮 内 变 态 反 应 试 验（SICTT）和γ-干扰素（IFN-γ）酶联免疫吸附试验 （IFN-γ-ELISA）对314 头奶牛进行检测。

1.3.2.1 皮内变态反应试验（TST）

首先，将待测奶牛颈中部上1/3处的毛剃掉， 直径约10 厘米大小，用游标卡尺测量奶牛原皮厚度并记录。

其次，在注射结核菌素之前，先使用75%的酒精对即将注射部位进行消毒， 用无菌注射器采用皮内注射的方法单独注射牛型结核菌素（BPPD） 和禽型结核菌素（APPD），出现豆大凸起即为注射成功。

最后， 再对牛注射BPPD 和APPD 72 小时之后观察注射部位是否有明显的红肿现象， 使用游标卡尺对注射部位中央皮皱厚度进行测量并记录， 根据判定方法及皮厚差的计算确定奶牛结核病的阴阳性。

1.3.2.2 比较皮内变态反应试验（SICTT）

与皮内变态反应试验类似，在奶牛颈中上部同侧或两侧同时注射牛型结核菌素（BPPD）和禽型结核菌素（APPD），分别记录注射前奶牛原皮厚度及注射72 小时之后中央皮皱厚度计算皮厚差进行判定。

1.3.2.3 牛全血培养

用肝素钠抗凝管采集至少5 毫升牛全血， 颠倒混匀后使肝素钠完全溶解，并在8 小时内进行培养。将采集的全血分装在24 孔板中，每份血样分装在三个孔中， 每孔1.5 毫升的血样并做好标记。 分别向三个孔中加入BPPD、APPD 和PBS 进行刺激后， 震荡1 分钟置37℃恒温培养箱中孵育16～24 小时。 孵育完成后， 收集上清液于1.5 毫升离心管中，即为γ-干扰素上清液，-20℃保存备用。

1.3.2.4 牛结核病γ-干扰素酶联免疫吸附试验（IFN-γ-ELISA）

试验前将所有试剂（除结合物）恢复至21℃±3℃。溶解冻干试剂，并平衡15 分钟。

每孔加入100 微升待检样品（不需稀释）和对照品（阳性、阴性和空白对照各一孔， 阴性对照加入到H10 孔， 阳性对照加入到H11 孔，空白对照H12 孔）至相应孔中。 在微量振荡器上振荡1 分钟， 彻底混匀。 封板，室温（21℃±3℃）孵育1 小时。 洗涤4 次。 洗液按配制方法制备，洗涤方法如下：迅速翻转ELISA板以倒空其内液体， 避免孔与孔之间的液体混合， 每孔中添加300 微升的洗液，轻摇微孔板，避免造成不同孔间的污染，迅速翻转ELISA 板以倒空其内液体，重复操作3 次。第4 次洗涤完毕后， 将酶标板放在干净的滤纸上拍打几次， 尽量除去残留的洗液。 每孔加入100 微升新鲜配制的酶标结合物，充分振荡混匀。封板，室温（21℃±3℃）孵育1 小时，洗涤4 次。洗涤方法同上。每孔加入100 微升底物溶液（TMB），充分振荡混合。封板，21℃±3℃避光孵育10分钟。 每孔加入50 微升终止液，轻轻摇动混匀， 终止后5 小时内读取OD450 纳米的值。

1.4 判定方法

1.4.1 布鲁氏菌病

虎红平板凝集试验和试管凝集试验中阴阳对照成立，“++++”为出现大的凝集片或小的粒状物， 液体完全透明，100%凝集；“+++”为有明显的凝集片， 液体几乎完全透明，75%凝集；“++”为有可见的凝集片，液体不甚透明，50%凝集；“+” 液体混浊， 只有少量颗粒物，25%凝集；“-”为液体均匀混浊。当被检血清1∶100 稀释度时，出现“++”以上的凝集现象则判定为阳性，1∶50 稀释度时出现“++”以上凝集现象则判定为可疑， 出现可疑反应的奶牛间隔一段时间后再次进行检测， 若结果仍为可疑，则可判定为阳性。

1.4.2 牛结核病

1.4.2.1 皮内变态反应试验（TST）

注射72 小时后测量的中央皮皱厚度与原皮厚度的皮厚差大于或等于4 毫米以上， 且有明显的炎症反应则判定为阳性， 用符号“+”表示；皮厚差2～3.5 毫米，有轻微炎症反应即为可疑反应， 用符号“±”表示；皮厚差在2 毫米以下，无炎症反应发生，则判定为阴性反应，用符号“-”表示；若判定结果为可疑反应的奶牛，间隔一段时间后进行复检，结果仍为可疑反应，则判定为阳性。

1.4.2.2 比较皮内变态反应试验（SICTT）

首先， 根据皮内变态反应判定标准进行判定，挑选出判定为牛型结核菌素阳性结果，牛型结核菌素皮厚差减去禽型结核菌素皮厚差的差值大于4 毫米则判定为阳性；若牛型结核菌素皮厚差减去禽型结核菌素皮厚差的差值大于1 毫米小于4 毫米则判定为可疑；若牛型结核菌素为阴性结果，或牛型结核菌素为阳性结果但皮厚差小于等于禽型结核菌素皮厚差的则判定为阴性。

1.4.2.3 IFN-γ-ELISA试验

当测得的BPPD 的OD值减去APPD 的OD 值大于或等于0.1，且BPPD 的OD值减去PBS 的OD 值大于或等于0.1 时， 判定结果为牛结核阳性；当测得的BPPD 的OD 值 减 去APPD 的OD 值小于0.1，或BPPD 的OD 值减去PBS 的OD 值小于0.1 时， 判定结果为牛结核阴性；当测得的APPD 的OD 值大于或等于BPPD 的OD 值， 且APPD 的OD 值减去PBS 的OD 值大于或等于0.1时，判定结果为禽结核阳性。

2 结果

2.1 牛布鲁氏菌病

使用虎红平板凝集试验对315份奶牛血清进行初步检测，检出阳性血清为122 份，阳性率为38.7%。使用试管凝集试验进行复检，检出阳性血清为115 份， 阳性率为36.51%。

2.2 牛结核病

2.2.1 试验结果

使用牛型结核菌素和禽型结核菌素进行皮内变态反应试验、比较变态反应试验、牛结核病γ-干扰素酶联免疫吸附试验 （IFN-γ-ELISA）结果见表1。由表1 可知，使用比较变态反应试验结果中，有10 份可疑阳性结核出现， 其皮内变态反应试验、比较变态反应试验、牛结核病γ-干扰素酶联免疫吸附试验（IFN-γ-ELISA）的数据结果见表2，其判定结果见表3。

表1 不同试验方法检测结果

2.2.2 结果分析

使用牛型结核菌素对314 头奶牛进行变态反应试验， 检出121份结果大于4 毫米， 阳性率为38.54%；使用禽型结核菌素进行变态反应试验，检出33 份结果大于4毫米，阳性率为10.51%。 比较变态反应结果为89 份阳性， 其中有2份为禽型阳性，10 份为可疑。 通过采集奶牛血液，对奶牛血液进行全血培养后收集到的γ-干扰素上清液进行IFN-γ-ELISA 试验，结果表明检测出有154 份阳性血液，阳性率为49.04%。

表2 10 头可疑牛不同方法试验结果

对于以上试验方法进行综合判定，结果表明121 头为牛型结核阳性，33 头禽型结核阳性，其中29头为牛型、禽型混合感染。 上述在比较变态反应中有10 份为可疑结核病奶牛， 其中耳号为160012 和160009 奶牛，APPD 变态反应判定为阴性，BPPD 变态反应、IFN-γ-ELISA 均判定为阳性， 综合判定为阳性；耳号为160819 和170721 奶牛，仅比较变态反应试验中判定为可疑， 而其余试验中均为阴性，则综合判定为阴性； 耳号为160917和170054 奶牛， 比较变态反应中判定为可疑，APPD 变态反应和BPPD 变态反应判定为阴性，IFNγ-ELISA 判定为阳性，综合判定均为阳性； 耳号为110113 和150812奶牛，APPD 变态反应和BPPD 变态反应判定为阳性，比较变态反应中判定为可疑，IFN-γ-ELISA 判定为阴性，综合判定为阳性；耳号为150920 和150943 奶牛，APPD 变态反应判定为阴性，BPPD 变态反应判定为阳性，比较变态反应中判定为 可 疑，IFN-γ-ELISA 判 定 为 阴性，则综合判定结果为阳性。

表3 10 头可疑牛不同方法判定结果

2.2.3 综合判定结果

综合上述分析， 在检测的314头奶牛中，共检测出牛型结核阳性121 头（其中29 头为牛型、禽型双阳性），10 头可疑牛中8 头确定为阳性。 牛型结核阳性率为38.54%，禽型结核阳性率为10.51%， 牛型、禽型双阳率为9.24%。

3 讨论

2019 年对石家庄栾城区奶牛场存栏奶牛的监测数据显示，牛布鲁氏菌病和结核病的阳性率仍处于较高水平，表明“两病”在养牛业广泛流行，严重影响了奶牛的正常饲养，阻碍了养牛业的经济发展。

奶牛“两病”检出的阳性率处于较高水平， 主要原因在于引进奶牛检疫不严格，防疫意识差，“两病”阳性奶牛的无害化处理困难两个方面。 首先， 我们应加强对奶牛春秋季“两病”的定期监测，及时掌握“两病”的发生发展动态，做到“早发现、早诊断、早报告、严处置”，确保全市人民的健康及畜牧业的发展。

其次， 根据国家检疫部门下发的相关规定， 对于自己养殖场内检测出的“两病” 阳性奶牛应进行淘汰， 这样会造成养殖户对于政府检测部门政策的不满， 同时又会加重政府的财政负担， 使检疫工作无法顺利展开。 对于政府部门应加强领导，提高“两病”检测阳性奶牛淘汰补助标准，使其规范化、制度化，确保对于监测出的阳性病畜顺利进行无害化处理。

再次， 政府部门应结合当地的特点， 对养殖户进行疫情防疫的知识普及，使人们对于“两病”的危害有一个更为清晰的认识， 通过不断的宣传工作提高养殖户的相关专业素养，让人们深刻明白“两病”对人类生命安全及养殖业发展的危害，并注重养殖场的规范性， 以更好地对“两病”进行防控，消灭“两病”的传染源。

（支持项目：河北省现代农业产业技术 体 系 奶 牛 创 新 团（HBCT2018120406；

HBCT2018120205），河北省现代农业产业技术体系肉牛创新团队（HBCT2018130405））