黄腐酸离体在体实验药理研究新进展

周霞萍 张 坤 周永全 朱天南 赵家永

1华东理工大学资源与环境工程学院 上海 200237

2南京富里康生物科技有限公司 南京 210000

3稷山兴乡腐植酸肥业开发有限公司 运城 043200

4云南格瑞环保工程有限公司 昆明 650106

5重庆双丰化工有限公司 重庆 402100

黄腐酸是腐植酸中的一种，腐植酸医药应用从唐朝柳宗元著《答崔黯书》开始有记载，历经宋、元、明、清，在1995年原化工部批准成立中国腐植酸工业协会医药专业委员会后得到了拓宽。2009年4月，曾宪成在“中医药国际论坛”上的报告《腐植酸医药面向国际论坛》反响强烈[1]。2018年5月，中国腐植酸工业协会在山东聊城召开“首届中华腐植酸医药健康产业发展论坛”[2]，会上众多专家的报告，如北京同仁医院袁申元[3]的报告、昆明理工大学李宝才[4]的报告等，点燃了新一代腐植酸人在腐植酸医药研发上的热情。会上，新一届“中国腐植酸工业协会医药专业委员会”成立，促进了腐植酸、黄腐酸的药理研究。鉴于黄腐酸的靶向性，深入药理研究有重要的现实意义[5]。

本文基于黄腐酸的优势和特点，运用相似论原则，即取类比象的思维方法，通过对大量的主、客体的相互类似现象的分析，找出各种各样的规律性[6]。按照黄腐酸的离体实验药理研究进展、在体实验药理研究进展、作者单位的案例分析以及研究展望的顺序展开论述。

1 黄腐酸的离体实验药理研究进展

离体实验是指通过体外实验方法观察实验药物的药理药效，实验对象主要为体外培养的各种细胞、细菌、病毒等病原体。离体实验的优点是不受个体差异干扰，能严格控制实验条件，重复性好。

早年，王言贵等[7]研究黄腐酸对抗体产生细胞（APC）、体外培养细胞及常见细菌、病毒的影响，结果表明：黄腐酸钠对体外培养细胞无毒性；许伟等[8，9]以离体大鼠皮肤为透皮屏障，用生理盐水为接受液，测定黄腐酸钠的透皮吸收量，结果表明：黄腐酸钠软膏以零级动力学的速率释放药，在无角质层的皮肤中，透皮速率是完整离体皮肤透皮速率的72倍；Jayasooriya R G P T 等[10]的离体实验研究显示，黄腐酸可增强小鼠单核巨噬细胞白血病细胞（RAW264.7）体外抗肿瘤介质，诱导肿瘤细胞体外凋亡；Huang W S 等[11]研究表明，黄腐酸可减弱耐药诱导的人结肠癌细胞（HCT-116）对内皮细胞的黏附作用；Chien S J 等[12]通过研究黄腐酸对同型半胱氨酸诱导的人单核细胞环氧合酶-2表达的调控作用，证实黄腐酸可减弱同型半胱氨酸诱导的人单核细胞环氧合酶-2对人体的影响，可减少患心血管疾病的风险；Sanmanee N等[13]研究了黄腐酸对猪输卵管上皮细胞（POEC）铜生物利用度的影响，结果表明：铜-黄腐酸（Cu-FA）在细胞内的吸收明显高于Cu2+的吸收，但对细胞的损伤作用比Cu2+要小，通过透射电子显微镜和光学研究及MINTEQA2的计算结果揭示，黄腐酸的亲水亲脂性质有助于Cu-FA 和黄腐酸与细胞表面结合，说明黄腐酸对POEC 的活性表面有较强的影响，改善了Cu2+的毒性作用，显示了黄腐酸对环境和动物健康的双重作用；Leighann S 等[14]对碳水化合物衍生的黄腐酸（CHD-FA）作为一种潜在的治疗口腔生物膜感染的药理药效进行了探究，结果表明：CHD-FA 具有广谱抗菌活性，并具有抑制炎症的辅助作用；由图1可以看出，CHDFA 抗菌效果明显，但不如抗菌药氯已定（CHX）的效果。

图1 使用CHD-FA 与未使用的区别Fig.1The difference between using CHD-FA and not using it

体外培养条件和相关学科的不断发展，可极大 地促进黄腐酸离体实验的药理研究。

2 黄腐酸的在体实验药理研究进展

在体实验是指在实验动物体内进行的药物作用观察、药理分析。实验动物包括正常动物、疾病病理模型动物。根据对实验动物的实验周期和用药次数不同，又分为急性实验、慢性实验、寿命延长实验以及致畸致癌实验。

北京同仁医院早期研究黄腐酸钠对药物性甲亢和甲低大鼠血浆环磷酸腺苷（cAMP）的影响，结果表明：药物性甲亢和甲低组大鼠，cAMP 呈显著或中等度升高，注射黄腐酸钠后，可在减轻甲亢或甲低症状；同时使血浆cAMP 水平显著下降或使之正常，由此推断黄腐酸钠可能具有调节cAMP的作用，它在临床所表现的多种药理作用可能与其对cAMP 的影响有一定关系[15]。杨光燃等[16～18]开展对胰腺胰岛素诱发的β-细胞的特点，建立糖尿病大鼠动物模型，得出黄腐酸钠对实验性糖尿病周围神经病变有一定的抑制作用，其作用机制可能涉及代谢和血管两个方面。何静等[19]采用腹腔注射四氧嘧啶诱导糖尿病小鼠造模，研究黄腐酸及黄腐酸钠的降血糖作用，并对其降糖机制进行初步探讨，结果表明：黄腐酸及黄腐酸钠明显降低小鼠体内血糖、总胆固醇、血清甘油三酯的含量，增加小鼠的口服糖耐量，得出黄腐酸及黄腐酸钠具有降血糖及改善脂质代谢作用。李月梅等[20]通过研究黄腐酸钠对小鼠胃肠运动及胃溃疡的实验，得出黄腐酸钠的急性毒性很小，具有止泻、抗胃溃疡、保护胃黏膜损伤的作用。Zhao Y等[21]以活体大鼠为模型，研究CHD-FA 是否可以作为增强伤口感染愈合的耐药病原体外用制剂，结果表明：CHD-FA 是一种很有前景的耐药伤口感染外用药物，能加速大鼠身上感染耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和耐多药铜绿假单胞菌伤口的愈合过程，这与其抗菌和抗炎特性是密切相关的。刘驰等[22]研究了黄腐酸钠对大鼠脑缺血再灌注损伤炎症反应的影响，结果表明：黄腐酸钠能明显改善血脑屏障通透性，减轻脑水肿、白细胞的浸润，降低缺血区脑组织中白细胞介素-1β（IL-1β）与肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的含量以及抑制核因子-κBp65（NF-κBp65）的活化，减轻脑缺血再灌注损伤的炎症反应，对脑缺血再灌注损伤具有保护作用。

在体实验的对象主要为大鼠、小鼠、家兔、家猫、犬、猕猴等。据统计，60%以上的药理学研究是通过在体实验完成的。在体实验动物在抗应激、调节神经-内分泌功能、促进新陈代谢、延缓衰老等药理研究中反应明显，可进行急慢性药效实验等。

3 案例分析

在查阅文献的同时，华东理工大学针对不同的黄腐酸样品，通过离体实验进行了药理作用研究，见表1。从表中可知，“富里康-FA”具有利水渗湿、活血化瘀为主的功能，同时还具有保肝、抗肿瘤、抗白血病等药理作用；“维媄玾”具有改善微循环的作用。“SXSJ-FA”样品，通过对黄腐酸空间结构的改变和衍生，获得了离体肿瘤细胞抑制率高于90%的药效，现正在形成发明专利。用表1中“富里康-FA”“维媄玾”“CQSFFAk”做肿瘤实验，对肺肿瘤细胞的抑制率也都在77%～85%之间。用酶标仪测定其中6个黄腐酸样品的超氧化物歧化酶（SOD）活性，由表2各药理实验数据显示，被测样存在的SOD 活性可催化O2-与H+结合，生成O2和H2O2，阻止中间产物的积累，因此，具有抗氧自由基、增加免疫等作用[18，19]。针对广西的1个黄腐酸样品（GXAYFA）进行药理实验研究，从图2可以看出，白血病细胞的存活率与黄腐酸的浓度成反比；而从图3可以看出，黄腐酸的降糖效果与黄腐酸的浓度成正比。黄腐酸的抗氧自由基、增加免疫等作用还可以发展跨越到草本类药妆品、生物农药等前沿领域[20～22]。

云南联合药业有限责任公司、复旦大学、华东理工大学等联合对黄腐酸进行药理实验条件与评价指标时，获得黄腐酸多靶向在体的药理实验设计示范（表3），当药效（抑制率）超过30%，在医学上要反复进行实验论证。

表1 黄腐酸的离体药理实验分析一览表Tab.1List of pharmacological experimental analysis of fulvic acid in vitro

表2 运用试剂盒-酶标仪法测得的黄腐酸SOD 活性Tab.2SOD activity of fulvic acid measured by the kit-enzyme labeling instrument

图2 四唑盐比色法（MTT）实验筛选GXAY-FA 抗白血病细胞存活条件Fig.2The survival conditions of GXAY-FA anti-leukemia cells by MTT screening

图3 不同浓度GXAY-FA 的降糖效果Fig.3The hypoglycemic effect of GXAY-FA at different concentrations

表3 黄腐酸多靶向在体的药理实验设计示范Tab.3Demonstration of multi-target in vivo pharmacological experiment design of fulvic acid

4 展望

生命科学的发展从宏观到微观，药理学的发展也由整体水平、器官水平、组织水平深入到细胞水平和分子水平。分子药理学是分子水平研究生物大分子的结构与功能、阐明生命现象本质与传统药理学交叉的新学科。作为现在药理学的主流，在受体、酶系统、离子通道、生物活性物质等方面促进药理作用机制深入到分子水平，为新药设计提供重要依据。黄腐酸的药理研究也需从分子方面揭示机理。

DNA（脱氧核糖核酸）、RNA（核糖核酸）和蛋白质是构成生命现象的分子基础，在目的基因获取、表达和打靶中都有具体的分子生物技术[23～28]。近藤友大[29]运用分子生物学手段研究了日本的土壤腐植酸性质；Yang H L 等[30]采用核小体间DNA断裂等凋亡特征，研究了腐植酸诱导细胞凋亡的效应；张国刚等[31]在含黄腐酸的天津海底淤泥提取方法研究中，采用分子生物学DNA 鉴定方式，研究了黄腐酸的抗氧化作用机制；Orsoya P 等[32]研究了β-葡聚糖和富维酸（批号：210515-012，主要成分中黄腐酸占70%，推荐的剂量250g FA/1000L饮用水）等4种饮用水补充剂对猪肠道上皮细胞水平的影响，虽各处理都未改变cyp3a29的基因表达，但β-葡聚糖和富维酸促进了内毒素治疗肠细胞中趋化因子il-8mrna 的生成；Hideko M 等[33]研究了黄腐酸（SS-FA，过剩污泥中所提取）对KU812细胞的印迹型过敏反应的芯片分析，得出SS-FA影响参与信号转导、细胞因子-细胞因子受体相互作用、免疫应答、细胞粘附分子等通道的基因表达。

当前，国际试剂公司阿拉丁（Aladdin）、西格玛（Sigma）、麦克林（MACKLIN）等都有具有CAS 登记号的黄腐酸，有的标注黄腐酸含量≥90%，有的标注分子量308.24、227.17；华东理工大学也测定出数均分子量500、1000左右的黄腐酸，也有拿到美国FDA 批号的黄腐酸，这为黄腐酸在医学上作更多的离体实验、在体实验，甚至细胞水平、分子水平上的药理研究减少了障碍。由此，将黄腐酸的生物医学药理跨越到兽药、农药、功能食品的研究开发，其用途将更广泛[34～47]。

致谢：本文的黄腐酸离体实验和部分在体实验的案例分析数据是在华东理工大学国家自然科学基金主持人刘建文教授所在的药学院上海市新药研发重点实验室完成的；除了论文标注的作者单位，还对山东泉林嘉有现代农业股份有限公司、库车物泰炭素有限公司、上海臻衍生物科技有限公司、南京臻旸生物科技有限公司的制样进行了测试研究，在此一并表示诚挚的感谢！