磁性纳米颗粒对不同模式生物的毒性研究

胡莉娟，沈沁浩，陈章悦，周家豪，热法提，吴奕帆，王成聪，费承鑫，李华玲

扬州大学医学院，扬州 225009

随着科技的发展，纳米材料越来越多地被应用于人们的日常生活。人们也越来越多地接触到纳米材料。但其对人类健康的影响及方式仍不十分清楚，尤其是磁性纳米颗粒(magnetic nanoparticles, MNPs)。磁性纳米颗粒具有纳米材料的表面效应和小尺寸效应，因此，较一般物质更容易通过呼吸、食道甚至皮肤等途径进入人体内[1]。近年来，磁性纳米颗粒在医学方面的新应用越来越多，如靶向药物载体、磁共振成像、生物分离、固定化酶以及免疫检测等[2-6]。但是关于磁性纳米颗粒毒性作用及作用机制还尚不清楚。因此，探究其是否对生物产生毒性作用具有重要意义。本文对MNPs作用于几种模式生物的研究进行了综述。

1 磁性纳米材料的特点(Characteristics of MNPs)

纳米材料是由颗粒尺度在1～100 nm的微小颗粒组成的固体体系，其颗粒绝大多数是晶体，特征尺度至少在一个方向上为纳米量级[7]。由于小尺寸效应、量子效应、表面效应和界面效应的影响，纳米材料除了有传统材料的优异性能外，还有许多传统材料不具备的新的优异性能，因此，它的应用涉及到力学、热学、电学、磁学、光学和生命科学等众多方面[8-12]。而磁性纳米材料作为纳米材料的一种，按组成可分为无机磁性材料和磁性聚合物纳米材料两类：无机磁性材料是指具有磁性的无机材料，如Fe3O4、Fe2O3、CoFe2O4和NiFe2O4等，因难分散且易团聚，极大地限制了这类材料的应用；磁性聚合物有很好的顺磁性、较高的饱和磁场强度、生物相容性以及较强的磁响应性等，通常可采用连锁聚合或逐步聚合的方法来制得磁性聚合物。所制备的磁性聚合物多带有可反应的活性官能团，从而得以进一步修饰制备出多功能的磁性聚合物。经过表面修饰的磁性材料不仅解决了团聚的难题，还在很大程度上改善了磁性纳米材料的生物相容性、稳定性及可生物降解等特性，是目前该领域的研究热点[13]。其中较为常见、并且被广泛应用和研究的有磁性Fe3O4纳米材料、MnFe2O4磁性纳米粒子、λ-Fe2O3超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPION)等。磁性纳米材料的特性，使其在生物医药、环境及军工等多方面具有难以被取代的特殊地位[14]。例如，Fe3O4磁性纳米材料可以用于磁共振造影剂，也可作为靶向药物载体或利用光热效应治疗肿瘤[15]；硅烷化反应制备乙二胺四乙酸(EDTA)官能化的磁性粒子EDTA-Fe3O4@SiO2可以将水溶液中Pb2+和Cu2+除去[16]。

近来研究发现，纳米颗粒会在肺脏、肝、脾、肾甚至骨髓和中枢神经系统[17]中沉积，并引起严重的肺部炎症[18]。沉积情况与纳米颗粒的性状和实验动物的差异有关[19]。同时，从已有研究中发现，不同修饰的磁性纳米材料对细胞、大鼠、小鼠和家兔在一定情况下有明显的影响作用，本文进行了以下总结。

2 不同磁性纳米材料对不同细胞的影响(Effects of different MNPs on different cells)

关于磁性纳米材料对细胞的影响，已有大量文献报道，这里将分为肿瘤细胞、免疫细胞和非免疫细胞3个方面进行介绍。

2.1 对肿瘤细胞的毒性作用

磁性纳米材料被用于研发靶向药物传递的治疗学，包括各种癌症治疗[20-23]。研究发现，Fe3O4/Al2O3和Fe3O4-mSiO2核壳结构[24-25]的磁性纳米粒子可以通过光热效应杀死细菌和KB癌细胞；体外抗肿瘤活性研究表明，纳米Fe3O4槲皮素多巴胺复合物对肿瘤细胞具有一定的选择性，对人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)、人前列腺癌细胞(PC3)均体现出较强的抑制活性[26]；带有磷脂-聚乙二醇(PEG)涂层的氧化铁纳米颗粒(iron oxide nanoparticles, IONPs)和阿霉素(DOX)对抗癌细胞时药物持续释放，使癌细胞凋亡增加，而高温可进一步加速癌细胞的凋亡[27]；Actein(即AT，从升麻根茎中分离出的一种三萜苷，有抗肿瘤作用)与Fe3O4(AT-MNPs)联合应用可诱导非小细胞肺癌(NSCLC)细胞凋亡，并以p53依赖的方式抑制NSCLC生长[28]。大量研究证明，多功能IONPs含有氧化铁核，表面包覆细胞毒性药物也可以与高温结合使用，以进一步证实抗肿瘤反应[29]。因此，磁性纳米材料对肿瘤治疗的作用是值得肯定的，表面包覆有抗肿瘤的化合物可能会增加对肿瘤治疗的作用。

2.2 对免疫细胞的毒性作用

纳米技术载体的使用总是需要评估对环境、职业和健康的潜在危险因素。其中一些不良反应包括超敏反应、免疫抑制和免疫刺激，这可能是免疫系统与纳米粒子之间“不受欢迎”的相互作用的结果[30]。关于磁性纳米材料对免疫细胞影响的研究也有很多。多个研究结果显示，暴露于IONPs中，U937单核细胞内IONPs增加[31]，刺激了Th1偏倚的免疫反应[32]，单核细胞驱动的内皮细胞功能障碍并引起动脉粥样硬化[33]。同时，Zhu等[33]的研究表明，IONPs可以激活单核细胞，之后单核细胞通过产生次级信使，导致细胞质空泡化、线粒体肿胀和人主动脉内皮细胞(HAECs)死亡。从该研究中推测IONPs的毒性可能会导致心血管并发症。也有研究发现，聚乙二醇(PEG)包被的IONPs增加了人单核细胞的活性氧(ROS)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、白细胞介素1β(IL1β)和线粒体功能障碍[34]，而葡聚糖包被的SPION被发现在干细胞和免疫细胞中积累，毒性最小或没有明显的毒性和功能变化[13]。另一项研究报告表明，淀粉包被的IONPs改变了细胞骨架和离子通道等微妙的特征[35]。相比之下，聚乙烯醇(PVP)包被的IONPs在不影响单核细胞存活的情况下，细胞内IL1β水平升高[36]。研究表明，葡聚糖包被的IONPs不影响内皮-单核细胞间的相互作用[37]，羧酸功能化IONPs阻止了脂多糖处理单核细胞的炎症细胞因子反应(IL1β、TNFα和IL6)[38]。这些数据可能表明，颗粒包被有助于免疫细胞存活和细胞因子的分泌，这是对IONPs或其他刺激的反应[29]。但是Tsolakis等[39]将与淀粉样β1-42(Aβ1-42)结合的硫代乳酸T标记核壳层SPION(Aβ1-42)注入巨噬细胞，发现整个实验过程中吞噬细胞的功能状态没有受到影响。大量研究发现，磁性纳米材料会引起免疫细胞的炎症反应，导致免疫刺激或免疫抑制。

2.3 对其他细胞的影响

体外评价研究表明，纳米氧化铁颗粒胶体悬浮液对人角质形成细胞(HaCat)活性、增殖和迁移缺乏毒性；体内急性皮肤毒性实验显示，皮肤生理参数值有一定的变化，皮肤屏障功能未受到明显影响[40]。壳聚糖包覆的纳米氧化铁颗粒(LMWC-IONPs)对哺乳动物细胞是安全的[41]。但也有文献报道磁性纳米材料有细胞毒性，例如，用Annexin V染色法测定经过纳米材料作用48 h后人乳腺MCF-7癌细胞的凋亡发现，Fe3O4纳米颗粒实验组的细胞凋亡率为14%，被葡聚糖包裹的Fe3O4实验组的细胞凋亡率为11%；细胞凋亡可能是由于细胞对Fe3O4纳米颗粒的大量摄取内吞导致的[42]。MNPs在培养6 h后通过内吞作用进入人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)引起的DNA损伤严重且难以修复，显示出一定的细胞毒性和遗传毒性[43]。多元醇制备的Zn0.8Co0.2Fe2O4在100 μg·mL-1急性暴露实验中对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)产生毒性，使其存活率显著降低[44]。“裸”磁性Fe3O4纳米颗粒在24 h暴露后致使人肝细胞(HL-7702细胞系)细胞活性显著降低，并呈剂量依赖性[45]。Fe3O4-TiO2也能降低HL-7702细胞活力和三磷酸腺苷(ATP)水平，而增加丙二醛(MDA)和ROS的生成，线粒体膜透性也发生损伤，Western blotting实验结果表明，Fe3O4-TiO2NPs能诱导细胞凋亡、炎症和癌变相关信号蛋白的改变，在低剂量(6.25 μg·cm-2)下，对HL-7702细胞无明显毒性[46]。与传统观念一致，大剂量长时间的暴露，可以明显增加磁性纳米材料的细胞毒性。

3 不同磁性纳米材料对大鼠、小鼠的影响(Effects of different MNPs on rats and mice)

鼠作为经常使用的实验对象，由于其饲养管理方便，易于控制，生产繁殖快，研究深入，因此，广泛应用于各种实验研究中。研究显示，未经改性与经油酸钠改性的纳米Fe3O4颗粒经ICR小鼠口服后，使其肝脏细胞脂肪变性，肺脏在光镜下观察到结构紊乱[47]。磁性纳米Fe3O4颗粒经尾静脉注射入小鼠体内24 h后，其血清生化分析发现，肝脏、肺脏和脾脏中Clathrin Heavy Chain蛋白表达增强，受到一定程度的损伤[48]。碳包覆纳米材料(CEINs)以剂量依赖性的方式诱导小鼠内皮细胞(HECa-10)线粒体和细胞膜的细胞毒性[49]。但大量文献发现，磁性纳米材料未对鼠类产生明显毒性。例如，经静脉途径给予昆明种小鼠nano-Fe3O4-Glu，未发现其有致突变性，但能通过血脑屏障、血睾屏障和血眼屏障，未见明确毒性[50]。对Wistar小鼠鼻内注射氧化铁纳米粒子发现，血小板计数增加，血清磷酸酶碱性水平下降，脑多巴胺和去甲肾上腺素水平升高，其他指标均正常，情绪和学习记忆能力不受影响，没有对鼠造成明显毒性[51]。高性能磁性Zn0.4Fe2.6O4在亚慢性胃内给药后对小鼠肝脏和肾脏均未产生明显毒性[52]。壳聚糖包裹的磁性纳米材料(Chit@MNPs)在大鼠的血液血管神经学和行为学上均未产生明显毒性[53]。多数实验没有发现磁性纳米材料对鼠类有明显毒性，但是并不能表明磁性纳米材料没有毒性，其毒性机制也尚未清楚。

4 不同磁性纳米材料对家兔的影响(Effects of different MNPs on rabbits)

实验兔是由遗传背景明确、来源清楚的家兔经人工饲养和繁育，并对其携带的微生物及寄生虫进行控制培育而成，广泛应用于科学研究、教学、生产、鉴定和其他科学实验。已有研究表明，磁性纳米Fe3O4颗粒以30 mg·kg-1剂量经耳缘静脉注射入家兔体内24 h后，发现其肺脏出现明显病理学改变[54]，但是对家兔肝脏和肾脏无明显损伤[55]。多元醇制备的Zn0.8Co0.2Fe2O4对新西兰兔肺、肝和肾产生组织毒性[44]。磁性纳米材料经静脉途径进入体内后，首先被免疫系统的巨噬细胞吞噬而聚集在巨噬细胞较多的组织和器官中，如肝脏和脾脏[55]。因此，磁性纳米颗粒进入家兔体内后，较多聚集在肝、脾、肾和肺等器官，当聚集浓度较高时，首先在这些器官出现组织毒性。

5 磁性纳米材料对秀丽隐杆线虫的毒性研究(Toxicity of MNPs to C. elegans)

5.1 磁性纳米氧化铁对线虫衰老的影响

有研究发现，纳米氧化铁能增强线虫细胞内ROS活性，导致细胞凋亡和死亡，最终导致蠕虫的早期死亡[56]。而超氧化物歧化酶(SOD)是一种重要的抗氧化酶，可清除体内的超氧化物。但Keaney和Gems[57]研究发现，编码SOD基因的缺失，确实会增加氧化损伤，但不会缩短寿命，甚至会增加寿命；同时研究发现，用具有SOD活性的化合物处理可提高对氧化应激的抵抗力，但对线虫寿命的延长没有作用[58-61]，而有一项初步研究确实发现了寿命延长的现象[62]，此外，增加活性氧产量可以增加而不是缩短寿命[61,63-64]，这些研究使人怀疑氧化损伤是否导致了与年龄相关的病理和死亡率的增加[65]。

衰老的特点是蛋白质稳态(蛋白质平衡)逐渐减弱。这导致蛋白质聚集增加，类似于在一系列神经系统和其他淀粉样疾病中观察到的蛋白质聚集，而膳食铁的增加显著加速了线虫体内与年龄相关的不溶性蛋白质的积累，其中主要包括核糖体、三羧酸(TAC)循环、氧化磷酸化和蛋白酶体等[66]。当线虫体内ROS水平升高时，活性氧自由基清除剂的活性或含量会出现一定的增加，而酶类抗氧化剂作为一种与年龄相关的不溶性蛋白质，它的增加，是否与线虫的衰老有关，还需要更多的研究证实。

5.2 CMC-nZVI, IONPs和亚铁离子对线虫生殖的影响

Brenner等[67]的研究发现，羧甲基纤维素(CMC)稳定的纳米零价铁(CMC-nZVI)、纳米氧化铁(nFe3O4)和亚铁离子(Fe(Ⅱ)ap)(aq表示水溶液)对线虫F0代产生明显生殖毒性，不同浓度均能提高线虫F0代细胞内ROS水平，考虑其生殖毒性可能是因为体内ROS水平升高引起的；F0代线虫仅接触一次CMC-nZVI，生殖毒性在F1和F2代中继续出现，在F3和F4代中得以恢复，但F1和F2代中ROS水平与对照组无显著差异，这表明氧化应激在F1和F2代中并不是以ROS积累的形式表达的，进一步测定了线虫体内Fe含量的差异，发现CMC-nZVI亲本暴露F0代体内铁总量呈剂量依赖性积累。虽然F1的总铁积累量与F1对照相比没有显著性差异，但总铁浓度的平均值仍明显增加，因此，推测CMC-nZVI亲本暴露可能导致F0和F1线虫总铁浓度的积累，从而导致线虫的多代生殖毒性。

秀丽线虫生长发育等各个方面研究的较为清楚，适合作为模式生物进行毒理学研究，从秀丽隐杆线虫得到的生物学知识也可以直接应用于更复杂的生物[68]，但目前关于磁性纳米材料对秀丽线虫的毒性研究并不多。已经发现的是磁性纳米材料的确会提高线虫体内氧化应激水平，但与线虫衰老和生殖毒性是否有直接关系及其影响的机制还有待研究；线虫体内铁储存蛋白铁蛋白(FTN-1和FTN-2)对氧化应激有保护作用[69]，暴露于磁性纳米材料中，线虫体内FTN-1和FTN-2是否发生变化？编码活性氧自由基清除剂的基因是否表达升高？具体表达升高的基因及其相关的机制通路都有待研究。

6 讨论与展望(Discussion and prospects)

磁性纳米材料近年来在生物医学领域颇为热门，相关研究也越来越多。虽然，其在抑制肿瘤细胞活性方面有明显作用，但是对人体可能存在一定的损害，临床或科研研究中使用应考虑到磁性纳米材料的不良影响。然而，关于磁性纳米材料毒理学研究众多，至今仍没有统一定论。总之，从以上文献中可发现(表1)，暴露于表面化学性质不同的SPIONs(裸露、COOH和NH2)后，不同的人类细胞类型(HCM、BE-2和HEK293T)显示出不同程度的细胞毒性和基因表达模式[70]。

不同性状的磁性纳米材料对不同细胞在低剂量时没有明显毒性，并且可以抑制肿瘤细胞的活性，但急性暴露或长时间暴露或使用裸磁性纳米材料时有明显毒性。而表面涂层，如有机和无机聚合物肽、纤维连接蛋白和葡聚糖，可改善生物制品的亲水性和保护生物制品免受损害。因此，为了减轻磁性纳米材料的毒性，可以考虑对其进行修饰。在小鼠和兔的实验中，磁性纳米颗粒易聚集于肝脏和肾脏等富含吞噬细胞的组织和器官，会导致病理学改变，但多数实验未见明显毒性。

秀丽隐杆线虫为具有神经细胞的多细胞生物[68]，其结构简单、易于观察，且与人类的多种生命活动调控机制相似，因此，秀丽隐杆线虫作为模式生物，用于磁性纳米材料毒性的研究近几年越来越多。从现有研究中可以发现，磁性纳米材料的确存在毒性，但是材料浓度、暴露方式、时间和实验对象的不同等，会有不同的结果。并且，因为磁性纳米材料的修饰物多种多样，不同文献实验内容有所差异，难以作出比较。磁性纳米材料的不同浓度、不同修饰物和不同接触方式在何种条件下对人体造成伤害？磁性纳米材料影响人体的方式及作用机制是什么？而秀丽隐杆线虫其体内的多种生物机制与人体有很多相似之处，以秀丽隐杆线虫作为模式生物，根据实验结果推测磁性纳米材料对人体的影响，可靠性更强。因此，利用秀丽隐杆线虫研究磁性纳米材料的毒性，是一个比较好的选择。

表1 磁性纳米颗粒对不同生物模型的毒性研究Table 1 Toxicity of magnetic nanoparticles (MNPs) to different biological models

续表1生物模型Model oganisms给药方式和暴露时间Administration route and exposure time磁性纳米颗粒类型Types of magnetic nanoparticles表面修饰物Surface chemistry大小/nmSize/nm主要观察Major observations主要结果Major results参考文献ReferencesARPE-19细胞ARPE-19 cell37 ℃,6、12、72 hMNPs含有氨基的有机层Organic layer containing amino30细胞毒性、基因毒性Cytotoxicity, genotoxicityDNA损伤,高浓度细胞坏死DNA damage, high concentration cell necrosis[43]细胞和新西兰兔HUVECs cell and New Zealand rabbits静脉注射,37 ℃、4 hIntravenous injection, 37 ℃, 4 hFe2+Zn2+、Co2+8细胞活性、兔体内影响Cytoactive, in vivoeffects in rabbits降低细胞存活率,兔体内组织毒性Reduce cell survival, tissue toxicity in rabbits[44]HL-7720细胞HL-7720 cell37 ℃、24 hFe3O4无Free8细胞毒性Cytotoxicity细胞活性降低,DNA损伤Decreased cell activity, DNA damage[45]HL-7720细胞HL-7720 cell37 ℃、36 hFe3O4TiO220～25细胞毒性Cytotoxicity可诱导氧化应激,潜在致癌Induce oxidative stress, possibly carcinogenic[46]Wistar大鼠Wistar rats鼻内注射,7 dNasal injection, 7 dFe2O3无Free30体内影响in vivo effects激素升高但无影响Hormone elevation but no effect[50]大鼠Rats尾静脉、24 hCaudal vein injection, 24 hFe3O4无Free9蛋白表达的影响Effect on protein expression网格蛋白表达增强Enhance expression of trellis protein[47]ICR小鼠ICR mice灌胃、14 dGavage, 14 dFe3O4油酸钠Sodium oleate15急性毒性Acute toxicity肝脾损害Liver and spleen injury[19]小鼠、HECa-10细胞Mice, HECa-10 cell37 ℃、24 hFe碳、羧甲基纤维素Carbon, carboxymethyl cellulose47～56细胞毒性Cytotoxicity线粒体、细胞膜毒性Mitochondria, cytomembrane toxicity[48]小鼠Mice尾静脉Caudal vein injectionFe2O3谷氨酸、放射性标记Glutamic acid, radioactive labeling15药代动力学影响Pharmacokinetic effect作用于肝脾,无细胞毒性Action on liver and spleen, no cytotoxicity[49]小鼠Mice灌胃、30 dGavage, 30 dFe2+Zn2+11.0±0.5肺毒性作用Pulmonary toxicity轻微炎症反应Mild inflammatory reaction[51]家兔Rabbits耳缘静脉Marginal auricular vein injectionFe3O4无Free9体内影响、生化改变In vivo influence, biochemical changes聚集于肝脾,无明显改变Gathered in the liver and spleen, without obvious change[54]L4线虫L4 C. elegans20 ℃、7 d氧化铁Iron oxide无Free36衰老、年龄Aging, age寿命缩短Loss of life[55]L4线虫L4 C. elegans20 ℃、24 hFe3O4CMC11.5±0.7生殖毒性Genotoxicity多代生殖毒性Multigeneration reproductive toxicity[66]

注： SPIONs表示λ-Fe2O3超顺磁性氧化铁纳米颗粒，IONP表示氧化铁纳米颗粒；AT表示黄肉楠碱，PEG表示聚乙二醇，PVP表示聚乙烯醇，CMC表示羧甲基纤维素。

Note: SPIONs stands for superparamagnetic iron oxide nanoparticles of λ-Fe2O3; IONP stands for iron oxide nanoparticles; AT stands for actein; PEG stands for polyethylene glycol; PVP stands for polyvinyl alcohol; CMC stands for carboxymethyl cellulose.