结核分枝杆菌细胞外RNA的研究现状

李婷 范云帆 付英梅

细胞外RNA(extracellular RNA，exRNA)指存在细胞外的所有RNA，包括转运RNA(transfer RNA，tRNA)、核糖体RNA(ribosome RNA，rRNA)、信使RNA(messenger RNA，mRNA)以及各类非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)[1-2]。目前发现的exRNA主要位于胞外囊泡中，也有部分以核糖核蛋白和脂蛋白结合的形式存在。在真核生物与原核生物细胞中均能观察到exRNA的包装和释放现象。人体中exRNA由多种细胞产生，在不同疾病中显示出差异性表达，所以有作为生物标志物的潜力[3-4]。此外，借助胞外囊泡的靶向作用，exRNA在靶向治疗的研究和应用上具有广阔的前景[5-6]。

近几年发现，结核分枝杆菌也能产生exRNA，这一过程与细菌分泌系统和宿主靶细胞外泌体密切相关。结核分枝杆菌的exRNA可影响宿主细胞免疫功能，从而对结核病的发生发展产生影响。并且，在感染结核分枝杆菌后，细菌exRNA可以被转运到宿主外周血和体液中，所以在筛选微创或无创生物标志物方面蕴藏着巨大的潜能。

一、 结核分枝杆菌exRNA的发现

20世纪70年代，人们就已在人淋巴细胞的培养基中，发现细胞释放的核蛋白复合物中存在RNA，并且认为这一过程是活细胞主动分泌而非细胞死亡裂解释放的[7]。早期对exRNA研究主要关注人类外周血和其他体液中人体基因组来源的exRNA[8-9]。近几年，研究人员开始探讨人体内共生或寄生的其他生物的基因组来源的exRNA，包括寄生虫、真菌、细菌产生的exRNA。

2012年，Obregón-Henao等[10]收集了结核分枝杆菌培养滤液，进一步用化学方法提取其中的RNA成分，并使用基因克隆技术和BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)分析确认了这些exRNA的长度和种类，这是研究者首次发现并证明了结核分枝杆菌exRNA的存在。作者发现这些exRNA在细菌培养的对数生长早期开始积累，长度在30～70碱基之间，以tRNA和rRNA为主。

随着深度测序技术的广泛应用，所发现的结核分枝杆菌exRNA的分子类型也不断增多。2015年，Singh等[11]结合深度测序技术，在结核分枝杆菌感染的小鼠巨噬细胞RAW264.7的外泌体中，发现了14种结核分枝杆菌的mRNA，例如Rv3809c、 Rv3533和Rv0243等。随后，其他研究者又陆续在人外周血中发现结核分枝杆菌的exRNA。2017年，Lv等[12]利用深度测序技术在人血清的外泌体中检测到结核分枝杆菌的rRNA和mRNA。通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法也可在人血浆游离RNA中检测到结核分枝杆菌小RNA(small RNA，sRNA)产物[13]。2019年，结核分枝杆菌来源的微小RNA(microRNA，miRNA)也在血清游离RNA中检测到[14]。

目前，已发现的结核分枝杆菌exRNA包括tRNA、rRNA、mRNA、sRNA和miRNA，这些RNA常以片段形式存在，长度在20～300碱基不等[10-15]。这表明多种类型的结核分枝杆菌RNA片段均可释放到细胞外。

二、 结核分枝杆菌exRNA的产生途径及机制

目前已发现的结核分枝杆菌exRNA的产生途径主要与胞外囊泡相关。细胞外囊泡是由细胞衍生的释放到外环境中的多种膜性囊泡的统称，在生物界中普遍存在。在原核生物中，革兰阴性菌产生的胞外囊泡源自外膜，因此通常称为外膜囊泡[16]。而革兰阳性菌、真菌以及分枝杆菌因存在厚细胞壁，对囊泡的产生机制还不清楚，这类原核生物产生的膜性囊泡依旧统称为胞外囊泡[17]。在真核生物中，依据产生的机制不同，胞外囊泡又可大致分为外泌体和微囊泡[18]。有关外泌体和微囊泡的生物学知识，van Niel等[18]已做出详细的介绍，此处不再赘述。

细菌胞外囊泡在exRNA的包装和分泌过程中起作用已在多种细菌中得到验证[19-21]。Dauros等[22]也在耻垢分枝杆菌的胞外囊泡中鉴定了RNA的存在。结核分枝杆菌能产生富含脂类、糖类和蛋白质成分的胞外囊泡[23-24]，并且分泌至培养滤液中RNA的含量与滤液中的蛋白含量呈正相关[10]。所以，笔者推测，在结核分枝杆菌培养基滤液中所检测到的exRNA很可能也是经细菌的胞外囊泡所包装和分泌。但目前为止，对结核分枝杆菌胞外囊泡中exRNA的鉴定，还没有明确的报道。

在感染宿主靶细胞后，作为兼性胞内寄生菌，结核分枝杆菌的exRNA主要通过宿主靶细胞的外泌体转运至细胞外[11,25]。虽然目前对于这一过程中exRNA的包装、细胞内转运和释放等机制还知之甚少，但最近有报道显示，结核分枝杆菌分泌系统中的替代型分泌系统(accessory Sec system，SecA2)可能参与感染细胞内细菌exRNA的细胞内转运过程。SecA2对结核分枝杆菌在巨噬细胞内的生长必不可少，它能通过影响v-ATPase来抑制吞噬体的酸化过程，阻止吞噬溶酶体的成熟[26]。2018年，Cheng和Schorey[15]发现SecA2介导H37Rv结核分枝杆菌RNA从菌体内释放到外环境的过程。在培养结核分枝杆菌时， SecA2功能缺失导致细菌培养滤液中exRNA表达消失，而在SecA2功能补充菌株的培养滤液中，结核分枝杆菌的exRNA的表达量恢复至野生型H37Rv水平。并且，作者发现，细菌进入巨噬细胞后，SecA2对exRNA的释放仍然起作用。结核分杆菌被巨噬细胞吞噬后，进入吞噬体，细菌在SecA2的介导下将细菌RNA释放到吞噬体中，接着在结核分枝杆菌 ESAT-6分泌系统1(ESAT-6 secretion system-1，ESX-1)的参与下，将细菌exRNA从吞噬体内分泌至巨噬细胞胞质中。

分泌到细胞质的结核分枝杆菌exRNA如何包装至外泌体的机制还不了解。不过，在SecA2缺失时，被结核分枝杆菌感染的巨噬细胞的外泌体中细菌exRNA显著下降[25]。这可能与巨噬细胞外泌体的生成有关。细胞内多囊泡体与质膜融合，将其腔内囊泡释放到细胞外而形成外泌体[27]。在外泌体的形成过程中，细胞质中的一些成分被隔离在囊泡中，包括蛋白、脂质以及核酸类物质[28-30]。所以可推测，当SecA2缺失时，因结核分枝杆菌的RNA不能释放到细菌细胞外，使巨噬细胞的胞质中结核分枝杆菌的exRNA表达降低，最终导致被包装到巨噬细胞外泌体的细菌exRNA表达减少。

除了在体外感染实验中验证了感染细胞外泌体中含有结核分枝杆菌 exRNA，在对结核病患者血浆外泌体的深度测序研究中也发现了结核分枝杆菌来源的exRNA[12]，提示在感染后，结核分枝杆菌的RNA可能通过宿主细胞外泌体的途径，被转运到外周血中。

三、 结核分枝杆菌exRNA对宿主细胞的影响

在感染的靶细胞中，结核分枝杆菌可直接将其RNA分泌到宿主细胞的胞质中，也可通过被感染细胞的外泌体，将细菌exRNA转运到临近或远离的未感染细胞中，从而发挥生物效应。这些病原体RNA可以作为“病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns， PAMP)”被宿主细胞中的胞质RNA传感器识别，最终调节宿主的免疫反应[31-32]。

干扰素(IFN)-β是Ⅰ型干扰素中的一员，结核分枝杆菌诱导IFN-β是激活先天免疫的重要步骤。之前研究报道结核分枝杆菌的DNA触发IFN-β的产生[33-34]。最近发现，结核分枝杆菌exRNA可以作为PAMP被胞质RNA传感器视维甲酸诱导基因蛋白I(retinoic acid-inducible gene I， RIG-I)识别，在RNA传感通路线粒体抗病毒信号蛋白(mitochondrial antiviral signaling protein， MAVS)和TANK结合激酶1的作用下，使干扰素调节因子7(interferon regulatory factor 7，IRF7)磷酸化，被磷酸化的IRF7形成同二聚体进入细胞核中促进IFN-β mRNA表达，最终使巨噬细胞中IFN-β蛋白的表达增多，从而驱动宿主的免疫反应[15， 25]。另一方面，巨噬细胞外泌体中的结核分枝杆菌exRNA可以通过RIG-I/MAVS途径促进骨髓来源巨噬细胞中吞噬体成熟，从而抑制结核分枝杆菌的生长[25]。这表明与靶细胞外泌体相关的结核分枝杆菌RNA有利于靶细胞的抗菌反应。

结核分枝杆菌exRNA也可以引起宿主细胞凋亡。研究者发现结核分枝杆菌培养滤液中的exRNA可以通过不依赖于TNF-α的caspase8信号机制损伤细胞膜，导致细胞凋亡[10]。结核分枝杆菌的外泌体exRNA转染至幼稚巨噬细胞后，可使细胞内的磷脂酰丝氨酸水平升高[11]。磷脂酰丝氨酸暴露增加与细胞凋亡的早期事件有关，提示外泌体exRNA可以诱导受体细胞凋亡的可能性[11]。巨噬细胞的凋亡不利于结核分枝杆菌生长和繁殖环境的形成，可引起细菌的清除，从而发挥内在保护作用[35]。这可能为结核病的治疗提供新的见解。

近期，Chakrabarty等[14]在人外周血中检测到结核分枝杆菌exRNA，通过生物分析预测了这些exRNA的靶基因及其功能，发现这些exRNA与宿主细胞的周期、凋亡、转录调控、mRNA加工、脂质代谢、细胞间通讯有关。提示结核分枝杆菌exRNA可能在影响宿主细胞功能上发挥多种作用。但是，目前exRNA功能性的研究仅在体外培养实验中得到验证，对于存在于人体内exRNA的功能还有待考究。

四、 结核分枝杆菌exRNA在医学中的应用

近几年，外周血或其他体液中来源于细菌的exRNA能否作为感染性疾病的诊断标志物引起了研究者的极大兴趣。2017年，Lv等[12]在对健康个体、潜伏性结核感染者和活动性结核病患者的血清外泌体测序中发现，在潜伏性结核感染者血清外泌体中检测到种类远超其余两组的结核分枝杆菌RNA。证明在结核分枝杆菌不同感染状态的人群中，血浆样本中来源于病原体的exRNA具有明显差异。对血清样本直接提取总RNA并测序后也发现，在结核病患者血清中检测到6个结核分枝杆菌来源的miRNA(MTBmiR1～6)，其中MTBmiR5在诊断肺结核患者时，敏感度为100.00%，特异度为90.91%[14]。另一项研究也发现，使用RT-PCR的方法检测活动性结核患者和健康人血浆中的结核分枝杆菌特异性sRNA，发现结核分枝杆菌的sRNA ASdes在两组间的检出率分别为55.56%和25.00%[13]。这证明了外周血中来源于病原体的exRNA在诊断感染性疾病中的巨大潜力，对利用这些差异表达的结核分枝杆菌RNA诊断结核病患者提供了理论依据。

mRNA作为疫苗，不仅肌内注射后可在局部肌细胞内翻译相应的蛋白质[36]，也可皮内注射后，在接种部位刺激产生趋化因子和细胞因子，从而促进机体免疫系统的激活[37]。细菌来源的mRNA也可作为疫苗，诱导宿主对细菌的免疫应答，为小鼠提供部分保护作用[38]。携带有结核分枝杆菌exRNA的巨噬细胞外泌体可以限制结核分枝杆菌在宿主细胞中的复制，与莫西沙星合用后，可协同降低巨噬细胞内和小鼠体内结核分枝杆菌的存活率[25]。这为结核分枝杆菌exRNA的疫苗研发及在治疗方面的应用提供了理论基础，并等待进一步的发掘。

五、 展望

近几年，exRNA的生成机制、生物学功能及作为疾病生物标志物的研究日益得到人们的关注，并取得一定的进展。美国国立卫生研究院也发起了细胞外RNA通讯联盟(Extracellular RNA Communication Consortium，ERCC)，致力于了解exRNA生物学功能及特性，并加快发展exRNA的研究和应用，将其作为潜在的治疗方法和诊断方法。目前结核分枝杆菌的exRNA研究尚处于起步阶段，关于其产生机制、生物学功能及其在临床医学上的应用还需做进一步探索。随着对结核分枝杆exRNA的研究进一步加深，或许可以为结核分枝杆菌感染的诊断、治疗及预后评价提供新的思路。