基质金属蛋白酶与特发性肺纤维化关系研究进展

肖雪 李龙

特发性肺纤维化(IPF)是一种病因不明的进行性和破坏性肺部疾病，预后极差，无有效治疗方法。它的特点是肺内沉积了过量的细胞外基质(ECM)蛋白，从而取代了肺的正常结构。基质金属蛋白酶(MMPs)是锌(Zn2+)依赖性内切蛋白酶家族，能够降解细胞外基质成分，如弹性蛋白、胶原蛋白、蛋白多糖、层粘连蛋白和纤维连接蛋白，这些成分也包含在肺实质中。此外，MMPs还调节多种功能，如细胞增殖、黏附、迁移、分化、血管生成和凋亡，它在IPF发病过程中的表达失控一直有所报道[1]，提示MMPs可能在IPF的发病或进展中起重要作用。近年来，越来越多的治疗药物被用于治疗IPF，根据国际指南，吡非尼酮和尼达尼布推荐用于IPF的治疗，尽管如此，IPF的治疗方案仍不令人满意，其药物不良反应的高发不容忽视[2]。因此，迫切需要寻找新的IPF治疗靶点。在此，本篇综述回顾了MMPs家族成员与IPF发病相关的证据，并总结出最新MMPs相关治疗IPF药物，旨在指导未来医学研究及临床面临的肺纤维化治疗。

1 MMPs

1.1 MMPs分类及分布 MMPs是高度同源的、多结构域的含Zn2+金属蛋白酶，被认为是细胞外基质(ECM)/核心基质蛋白降解的主要效应因子。MMPs以可溶性或细胞膜锚定的蛋白酶形式产生，裂解ECM组分具有广泛的底物特异性。MMPs在母体重构中的作用非常复杂，因为这些内肽酶的影响范围很广。它们不仅负责ECM的降解，还能脱落细胞膜蛋白，加工和切割被认为是基质相关蛋白的各种生物活性介质，如生长因子、细胞因子和趋化因子，通过直接切割或从细胞外基质结合库中释放它们来调节它们的活性[3]。

已在脊椎动物中识别出24种已知的基质金属蛋白酶，其中人类包括23种。根据靶底物和化学结构，基质金属蛋白酶分为以下七大类[4]：(1)间质胶原酶(MMP-1，MMP-8，MMP-13和MMP-18)。(2)明胶酶包括明胶酶A(MMP-2)和明胶酶B(MMP-9)。MMP-2和-9一直被认为是ECM蛋白水解降解的主要贡献者。(3)基质溶菌素(MMP-3，MMP-10，MMP-11和MMP-19)，具有与胶原酶相同的结构域排列，但不切割间质胶原。(4)基质金属蛋白酶(MMP-7和MMP-26)，它们都缺乏血红素结构域和铰链区。(5)膜型MMPs(MT-MMPs)包括MMP-14，MMP-15，MMP-16，MMP-17，MMP-24和MMP-25)：它们在细胞内被激活，活性酶在细胞表面表达。(6)其他MMPs(MMP-12，MMP-19，MMP-20，MMP-21，MMP-22，MMP-23，MMP-27和MMP-28)。(7)MMP-4,MMP-5,MMP-6和MMP-22在其中缺失因其证明与其他成员相同。MMPs由结缔组织、促炎细胞和子宫胎盘细胞分泌，包括成纤维细胞、成骨细胞、内皮细胞、血管平滑肌(VSM)、巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和滋养细胞[5]。由于MMPs在ECM重塑中起主要作用，因此它们在大多数结缔组织中高度分布。

1.2 MMPs结构 MMPs是多结构域蛋白，这些依赖锌和钙的内肽酶显示出显著的结构同源性，通常由3个结构域组成：N-末端信号序列、前肽结构域、催化结构域和类血凝蛋白C-末端结构域的多结构域蛋白[6]。前肽区由大约前肽含有约80～90个氨基酸，其中有一个高度保守的序列(Pro-Arg-Gly-Cys-X-Pro-Asp)。钙依赖的催化结构域(大约140～200个氨基酸)，对于所有的MMPs来说都是高度相似的，活性位点包含一个决定底物特异性的疏水性S1-口袋。催化结构域通过富含脯氨酸的铰链区(75个氨基酸残基，)与类血凝蛋白C末端连接。这个类血凝蛋白C末端结构域是同源性最低的结构域，主要负责调节底物特异性和蛋白质相互作用的位点。

大多数MMPs还具有以下特点：(1)MMPs与胶原酶-1(MMP-1)具有同源性。MMP-7、MMP-23和MMP-26是例外，因为它们缺少连接肽和血凝蛋白结构域。MMP-23具有独特的半胱氨酸富含结构域和紧接在催化域C末端之后的免疫球蛋白样结构域。(2)MMPs含有半胱氨酸开关基序PRCGXPD，半胱氨酸巯基螯合活性部位Zn2+，从而使MMPs保持其非活性的MMP原形式。(3)MMPs的催化域含有一个Zn2+结合基序和一个保守的蛋氨酸序列XBMX(Met-Turn)，在保守的谷氨酸的辅助下，Zn2+被来自保守序列HEXXHXXGXXH的3个组氨酸结合到该基序上，而保守的蛋氨酸序列XBMX(Met-Turn)位于支持催化Zn2+周围结构的Zn2+结合基序下方的8个残基上[7]。

1.3 MMPs调控 在正常生理条件下，MMPs受到严格调控并低水平表达。这些酶的失调和过度表达与各种疾病有关，包括神经退行性疾病、心血管疾病、肺部疾病、关节炎、中枢神经系统(CNS)疾病，包括癫痫、各种类型的癌症等。细胞因子(白细胞介素-1和-6)、转化生长因子(TGF)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、血小板衍生生长因子(PDGF)、碱性成纤维细胞生长因子(BFGF)和某些激素可促进MMP的表达[8]。它们在多种生理过程中发挥着重要作用，包括发育、伤口愈合、组织重构、器官形态发生、血管生成等。

转录后调控过程包括mRNA稳定性、蛋白质翻译效率和microRNAs的调控。翻译后，不同MMPs的酶原激活可能发生在细胞内、细胞表面或细胞外空间[9]。MMPs的活性可被不同的机制和分子所抑制，如TIMP蛋白家族(TIMPs)、α2-巨球蛋白和膜相关的RECK(具有Kazal基序的逆转诱导的富胱氨酸蛋白)[10]。通常，几乎所有MMPs都可被TIMP抑制。TIMP通过与MMP形成紧密结合的抑制复合物，并结合MMP活性位点上的锌原子，从而特异性抑制MMP并调节ECM转化和组织重构。因此，TIMP的作用涉及维持ECM形成和ECM击穿之间的平衡。

2 MMPs与肺间质疾病的关系

IPF是由于肺泡上皮细胞微损伤引起的创面愈合异常所致，肺泡上皮细胞微损伤主要发生在双肺不同的小区域，主要发生在基底和胸膜下。在这个持续的修复过程中，肺泡上皮产生各种细胞因子和生长因子，促进局部成纤维细胞和循环成纤维细胞及其转化生长因子β1(TGF-β1)介导的转分化为肌成纤维细胞[11]。此外，当上皮细胞发生上皮-间充质转变(EMT)时，这种转变有利于成纤维细胞群体的增加。一些遗传和表观遗传重编程负责驱动细胞结构和形态的改变，以及上皮细胞的粘附和迁移，以获得间质转变。多种MMPs的不协调调控和表达可能是IPF肺微环境严重结构重构的罪魁祸首。

最初认为MMPs可以通过降解肺中的ECM蛋白来限制肺纤维化，然而，在肺纤维化(PF)模型中，大多数对MMP缺陷小鼠的研究都显示了相反的结果。在小鼠PF模型中对基因靶向小鼠的研究表明，大多数MMP促进(而不是抑制)PF的发展[12]，这些机制包括：(1)促进上皮向间充质转化(MMP-3和MMP-7)；(2)增加肺内促纤维化介质的水平或活性或降低肺中抗纤维化介质的水平(MMP-3，MMP-7和MMP-8)；(3)促进异常的上皮细胞迁移和其他异常修复过程(MMP-3和MMP-9)；(4)诱导肺巨噬细胞表型从M1转变为M2型(MMP-10和MMP-28)。MMP-13和MMP-19在PF小鼠模型中具有抗纤维化活性，而MMP-1和MMP-10，有可能限制对损伤的纤维化反应。

2.1 MMPs与上皮细胞的损伤 上皮细胞在肺中起着重要的屏障功能，但它们在肺纤维化的形成过程中也起着关键作用，它们既能分泌前列腺素E2(PGE2)等抗纤维化或抗炎介质，又能分泌促纤维化因子。普遍认为上皮细胞应激(如感染)会导致慢性或反复的肺损伤，进而促进纤维增生。

一项实验表明，MMP-3的血浆蛋白(CCL18)可作为IPF疾病进展的预测因子[13]，提示该蛋白可能成为为新的靶点发现或未临床试验设计提供信息。MMP-7在所有黏膜上皮细胞的损伤反应中起着重要的作用，由肺上皮细胞、单核吞噬细胞和纤维细胞表达。Bauer等[14]首次证明MMP-7可成为IPF患者肺功能下降和疾病进展的可靠预测指标。在IPF患者队列中的一项前瞻性登记纵向抽样研究中，确定MMP7、表面活性蛋白D(SP-D)和KL-6(识别MUC1合成的人类蛋白的抗体)是上皮损伤的标记物，表明联合检测这三种蛋白具有潜在的临床价值[15]。MMP-28是MMPs家族的最新成员，它在IPF肺上皮细胞中过表达。有证据表明，MMP-28通过诱导转化生长因子-β依赖的机制可导致上皮向间质的转变，这是一个与特发性肺间质纤维化发病机制有关的生物学过程[16]。Maldonado等[17]提出超过4.5 ng/ml的MMP-28水平可显着增加IPF诊断的几率，MMP-28可提高IPF诊断确定性。

2.2 MMPs与肌成纤维细胞分化 肌成纤维细胞被认为是在PF的发生和发展过程中胶原和其他ECM成分沉积的原因。然而，使用报告鼠检测1型胶原和α-SMA的新证据表明，肺中大多数产生胶原的成纤维细胞是α-SMA阴性，而在肝脏是α-SMA阳性,在肺中，α-SMA阴性的成纤维细胞似乎保留了激活转化生长因子β并促进纤维化形成的能力[18]。无论如何，肌成纤维细胞确实在PF中积聚，最近对其活化和表型的许多研究集中在MMPs，特别是MMP-19和MMP-9。

MMP-19在IPF患者增生的上皮中高表达，普遍认为它通过调节环氧合酶-2的表达从而调节前列腺素的合成而起到保护作用。前列腺素在限制肌成纤维细胞分化中具有重要作用[19]，导致MMP19/小鼠对博莱霉素的反应发展成更严重的PF。事实上，MMP-19在肺上皮细胞中的过表达可以限制共培养中成纤维细胞的增殖[20]。基因阵列分析显示，MMP-19/肺成纤维细胞显示胶原基因和蛋白的产生增加、α-SMA的表达增加[21]，MMP-19缺失的肺成纤维细胞表现出显著的增殖，表明MMP-19在PF中有保护作用。

而MMP-9在IPF成纤维细胞病灶和博莱霉素治疗的小鼠的BALF[22]中高表达。BMAL1(生物钟的转录激活剂)，激活了典型的TGF-β1信号通路，因此刺激了EMT和MMP-9的产生以促进纤维化的发展[23]。在纤维化发生早期，肺表面活性物质显著下调TGF-β的表达而抑制肌成纤维细胞的分化和细胞外基质的沉积，它还可以增加蛋白水解活性ED1阳性巨噬细胞中MMP-9的含量[24]，从而增加ECM的降解。最近一项研究发现，敲除血清趋化因子配体14(CXCL14)基因可降低MMP-9表达可阻止细胞纤维化[25]。MMP-9与胸腺基质淋巴生成素(负责T细胞成熟)一起参与巨噬细胞诱导的肺泡上皮细胞EMT[26]，Sirtuin6可抑制这种MMP-9介导的EMT[27]，使转化生长因子-β1/Smad2信号轴失活。

2.3 MMPs与ECM重构 IPF是一种以ECM异常重构为特征的进行性、致死性间质性肺疾病(ILD)。异常的ECM重构被认为是导致肺内胶原瘢痕组织持续沉积的原因，异常的ECM重构被认为是导致肺内胶原瘢痕组织持续沉积的原因，ECM分解可直接影响免疫细胞激活。Ⅰ型胶原的有效生物活性三肽PGP片段，它是一些CXC趋化因子(如IL-8)的分子模拟物，可通过与其CXCR1和CXCR2受体结合来吸引中性粒细胞。MMPs具有很强的明胶溶解活性(如MMP-9、MMP-13等)，在脯氨酰内肽酶进一步降解明胶片段形成PGP之前，先天免疫细胞释放的蛋白质可以裂解胶原。在吸烟诱导的COPD中[28]，强有力的临床研究支持这样的假设，即PGP介导的免疫调节提供了一个正环回系统，该系统可能不依赖于获得性免疫。MMPs除了通过产生效应器ECM片段影响免疫功能外，还可以通过一系列机制影响免疫细胞的内流和激活状态。已经证明，主要由巨噬细胞表达的MMP-12和MMP-28可以改变巨噬细胞向肺内的募集[29]，而天然金属蛋白酶抑制剂TIMP3[30]可以减弱肺内巨噬细胞的激活。

2.4 MMPs相关信号通路 现在公认的是，MMPs影响许多信号通路，这些信号通路共同促进了IPF肺的纤维化环境，也可能作为有效的生物标志物。

Wnt/β-catenin信号通路在成纤维细胞的激活中起着至关重要的作用[31]，阻断该通路传导可能抑制成纤维细胞活化并损害肺纤维化的发展。2003年，首次报道了β-catenin在成纤维细胞病灶中的表达，以及它与Wnt下游靶基因CCND1和MMP7在邻近增殖性细支气管病变中的表达和共存[32]。研究证明活化的Wnt/β-catenin信号传导可以诱导其靶基因MMP-7的表达[33]。Cao等[34]提出抑制Wnt/β-catenin信号通路通过抑制MMP-2的表达而发挥抗纤维化作用。这些均提示靶向Wnt/β-catenin信号通路可能是治疗特发性肺纤维化的有效途径。

在博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化模型中，已经证明活化的转化生长因子-β/PI3K/AKT通路与肺泡重构和纤维化有关[35]。此外，转化生长因子-β诱导的miRNA(MicroRNA)转录与其他信号通路之间的串扰在促进肺间质纤维化方面起着重要影响[36]。最新研究发现，miR-31和miR-184分别是介导转化生长因子-β诱导的信号通路如转化生长因子-β-SMAD2和PI3K-AKT-NF-κB的增强子和抑制剂，并调控促纤维化基因RUNX2和MMP7的表达，提示miR-31和(或)miR-184可作为IPF治疗的新靶点[37]。

Fas/FasL凋亡通路参与了人IPF和博莱霉素诱导的啮齿动物肺纤维化。FasL是一种属于TNF家族的Ⅱ型跨膜蛋白，具有诱导Fas+靶细胞群快速死亡的能力。已经证明IPF中的肌成纤维细胞通过分泌sFasL来抵抗FasL和T细胞诱导的细胞死亡[38]，而基质金属蛋白酶能将mFasL膜结合形式切割成可溶性sFasL，Mahalanobish等[39]发现在IPF肺肌成纤维细胞和经博莱霉素处理的小鼠肺肌成纤维细胞的培养中，以及MMP-7基因敲除小鼠的血清中，sFasL的表达降低，表明IPF肺肌成纤维细胞通过MMP-7将mFasL裂解为sFasL来抵抗细胞死亡。该研究体现了MMP-7活性与纤维化进展之间的联系。

3 MMPs相关抑制剂

治疗IPF的药物有不可避免的不良反应，这一局限性为使用MMP治疗IPF开辟了一个新的天地。金属蛋白酶在伤口修复、血管生成、细胞因子和趋化因子释放等方面具有复杂的生物学功能，提示它们可以调节IPF中异常的肺泡重构。下面从以下三种方面介绍目前最新MMPs相关抑制剂的药物研究进展。

3.1 合成MMPs抑制剂 这种方法是针对MMP活性的上游诱导剂，设计特异性的MMPs抑制剂(MMPIs)或干扰剂。伊洛马司他作为MMPs的合成抑制剂，可抑制MMP-2和MMP-9的表达[40]，提高肺泡细胞存活率。Ma等[41]首次研制出两种新型的电化学阻抗谱生物传感器，其原理是基于MMP-14的血凝蛋白样结构域(PEX)与其抑制肽的结合作用，用于MMP-14的高灵敏定量。因此设计更特异的MMPIs或其他方法来降低促纤维化的MMPs的产生，或上调肺内抗纤维化的MMPs的产生，可能会开启IPF的治疗前景。

3.2 天然MMPs抑制剂 从人类进化的历史来看，天然产物对疾病的治疗具有巨大的意义。天然产物衍生的MMPI由于其极小的不良反应而引起了更多关注。研究人员筛选了大约90种草药提取物，其中黄芩苷、肉桂、卫矛和厚朴可以有效地抑制MMP-9的活性。著名的中药旱莲草(Eclipta prostrata L.)通过降低COX-2，TGF-β1，MMP-2和α-SMA的表达成功降低了肺纤维化进程，并降低了MMP-9和TIMP-1的比例[42]。在博来霉素诱导的纤维化模型中中药复方川芎抗纤颗粒(CCKG)可有效降低MMP-2和MMP-9的表达并减少TNF-α，IL-6和IL-1β的反应[43]。芥子酸是一种众所周知的多酚化合物，有助于恢复抗氧化系统并抑制TNF-α，IL-1β羟脯氨酸的产生，它可显著减少MMP-7和TGF-β的产生，从而解决纤维化病[44]。姜黄素是一种有效的抗炎分子，可抑制炎性因子的产生，并抑制NF-κB介导的炎症，吸入可吸入姜黄素的聚乳酸-羟基乙酸大孔微粒(LPMPs)可成功减少MMP-9的产生和Ⅰ型胶原的合成，以减缓PF发展[45]。因此，这些天然MMPI可能下调这些纤维化MMP的产生，并成为抑制PF的潜在膳食补充剂。

3.3 基因沉默 抑制MMP的另一种可能方法是开发反义和siRNA技术。反义策略选择性针对特定MMP的mRNA，从而导致RNA翻译减少和MMP合成下调。最近，使用含纳米颗粒的PG和siRNA联合治疗进行组合治疗MMP-3，CCL12，HIF-1α显示出严重的肺损伤限制和PF进一步发展[46]。miRNAs(21～23个核苷酸)是一类小的、非编码的、内源性的单链RNA，由于其调控基因表达的能力，被认为是一类很有前途的PF治疗干预体。使用miR-29c可通过抑制二氧化硅诱导的PF中的Wnt/β-catenin途径而引起MMP-2和MMP-9的下调[47]具有kazal基序的诱导还原的富含半胱氨酸的蛋白质的3’-UTR(Reck)可以通过抑制miR-497-5p的活性来抑制MMP-2和MMP-9的合成[48]。MiR-411下调MMP-2的表达以减轻静脉壁纤维化[49]。尽管关于miRNA在PF领域中的意义仍未进行广泛的研究，但是miRNA消除纤维化的能力表明其在PF中的未来应用。

4 与MMPs相关的其他治疗

4.1 纳米技术 在IPF治疗中，炎性反应的过度激活和促纤维化作用导致抗纤维化效果不理想。Chang等[50]构建了一种新型的内源性细胞靶向纳米平台(PNCE)，PNCE是新型MMP-2反应肽(E5肽)修饰的工程脂质体，通过调节M1/M2巨噬细胞进入平衡状态来抑制成纤维细胞的过度激活，从而增强IPF的治疗效果。值得注意的是，负责负载药物的pNCE，在免疫抑制剂秋水仙碱(Col)存在的情况下，加上尼达尼布(NIN)后抗纤维化能力有明显的增强，提示免疫调节剂与抗纤维化药物联合应用的纳米工程免疫抑制治疗是提高IPF治疗效果的有效策略。

4.2 替代药物 就治疗纤维化的安全性和有效性而言，补充和替代药物已显示出相当大的潜力[51]。因此中草药和昆虫作为治疗IPF的潜在药物受到了极大的关注。康复欣口服液(KFXOL)是一种经中国食品药品监督管理局(CFDA)批准临床使用的药物，是由美国蟑螂的乙醇提取物制成的。此外，一项研究表明美洲大蠊提取物通过抑制转化生长因子-β1、核因子-κB(NF-κB)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)来减轻CCl-4诱导的大鼠肝纤维化[52]。而在肺纤维化模型中，康复欣能显著减轻博莱霉素(BLM)气管内诱导的肺纤维化，并减弱MMP-1、MMP-9和金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)的表达[53]，提示康复心口服液在肺纤维化的治疗中具有潜在的应用价值。JNK酶功能是肺纤维化过程中关键步骤所必需的，在JNK抑制剂CC-930在屋尘螨诱导的小鼠气道纤维化模型中，数据显示CC-930显著降低MMP-7蛋白和mRNA的表达，并减轻细支气管周围纤维重构和胶原沉积，这支持CC-930作为治疗纤维化气道疾病的一种可行候选药物的潜力[54]。一项研究表明治疗多发性骨髓瘤(MM)的药物沙利度胺，可抑制转化生长因子-β1诱导的CCL149细胞肺泡上皮向间充质转化，降低MMP-2/-9和Ⅳ型胶原的表达，表明其抗肺纤维化作用，提示沙利度胺可能是一种有价值的抑制肺纤维化的治疗药物[55]。

4.3 联合治疗 IPF发病机制涉及多种途径，未来的IPF治疗需要联合抗纤维化治疗。季铵除草剂的PQ中毒后大鼠肺组织羟脯氨酸含量明显升高表明PQ的致纤维化作用，实验证明吡非尼酮可抑制PQ诱导的MMP-2和TIMP-1的升高，而吡非尼酮与强的松龙合用时，效应则被夸大，这种作用可能通过抑制氧自由基的产生和随后由PQ产生的炎性细胞聚集，抑制成纤维细胞的增殖，从而产生抗纤维化作用[56]。最新研究显示干扰素-γ(IFN-γ)联合吡非尼酮(PFD)都可以逆转TGF-β1对MMP-1，MMP-2，MMP-3，MMP-7和MMP-9的作用，而只有PFD可以促进TIMP-1和TIMP-2的表达和释放，这两种药物可能通过改变基质金属蛋白酶/基质金属蛋白酶的平衡，抑制肺成纤维细胞的活化和分化，具有协同/相加作用，该研究表明IPF中吸入性IFN-γ和PFD的联合治疗是新的、有前途的方法，值得在IPF临床试验中进一步探索[57]。

IPF的诊断仍然具有挑战性，需要多学科的方法。目前可用的治疗方法疗效有限，而且该病的总体预后仍然很差，所以目前最重要的是早期诊断，早期治疗。由于MMP表达和调控的复杂性，其在诱导肺纤维化损伤中的作用尚不明确。MMPs在不同组织、不同细胞类型中的表达既有有益的影响，也有有害的影响。本综述总结了MMPs与IPF发病关系相关的证据，并阐述了最新MMPs相关抑制剂及与MMPs相关治疗IPF的药物，旨在指导临床治疗。