高脂饮食和链脲佐菌素建立2型糖尿病大鼠模型的影响因素

黎娅，吴穹，马晓雨，常秀君，韩蕙竹，何敏，解安达，范培云

（青海大学，青海 西宁 810001；*青海省人民医院，青海 西宁 810007）

糖尿病的患病率逐年增加，据估计，到2040年全球约有6.24亿人患有糖尿病[1]。其中2型糖尿病占糖尿病总数的90%～95%[2]。2型糖尿病有着复杂的病理过程，患者通常会经历高胰岛素血症、胰岛素抵抗和血脂异常的肥胖状态，这个时期常常表现为糖耐量异常，称为糖尿病前期。随着病程的发展，继而出现胰岛素缺乏，进展为高血糖状态。为了更好的模拟这一发病过程，建立具有临床相关的2型糖尿病（T2DM）动物模型，高脂饮食（HFD）联合链脲佑菌素（STZ）这一方法广泛应用于糖尿病研究。

1 HFD-STZ-T2DM发展历史

1963 年，STZ被首次用于诱导糖尿病动物模型。1976年，A.Like等[3]发现单次静脉或腹腔注射小剂量的STZ可以成功诱导T2DM模型。2000年，Reed等[4]发现用40%脂肪供能比饲料喂的SD大鼠，表现出比对照组更高的血清胰岛素水平，但血糖水平并无差异，其特点类似于人类2型糖尿病前期。随后Reed等继续给予STZ（50 mg/kg）尾静脉注射，大鼠血糖水平明显升高，HFD联合STZ成功诱导了T2DM模型，这也是该模型首次被报道。Srinivasan等[5]在之后的研究中将STZ注射方式改为腹腔注射并采用较低剂量STZ（35 mg/kg）。Zhang等[6]在该模型基础上，将STZ注射改为小剂量连续两次注射，据报道，该方法能够避免单次大剂量诱导β细胞快速死亡。至今，以上三种方法被广泛用于建立2型糖尿病动物模型，但受不同方面因素的影响，造模方式也存在一些差异。

2 HFD

HFD能够很好地模拟糖尿病前期肥胖、胰岛素抵抗、糖耐量减低、血脂紊乱等特征。尽管HFD被广泛用于T2DM大鼠模型制备，但高脂饲料的种类及喂养时间却不尽相同。现今常用的高脂饲料有两大类：第一类在普通饲料的基础上添加一定比例的动物油、糖、蛋黄、胆固醇、胆酸钠等，改变饲料中脂肪和碳水化合物的能量供应比，如加入12%猪油、10%蛋黄粉、2%胆固醇、0.5%胆盐[7]。在基础饲料中添加上述物质，看似操作简单，但饲料中所有的营养物质含量都产生了相应变化，基础饲料中各营养成分被稀释，实验动物在摄取高脂饲料的同时，可能会造成营养物质摄入不均衡，影响实验结果。有研究者[8-9]为了避免蛋白质减少会添加适量奶粉、鸡蛋或酪蛋白，尽管酪蛋白氨基酸充足，仍然无法避免蛋氨酸摄入不足。第二类为纯化的饲料，进一步细分了各组分营养物质的配比，包括酪蛋白、淀粉、蔗糖、纤维素、动植物油脂、无机盐和维生素等。具有营养物质含量准确、配方规范、开放性高、易于修改、不含对实验结果有干扰的杂质、易于设置平衡对照组等优点[10]，但纯化饲料造价昂贵，生产企业较少，限制了其应用。除了高脂饲料种类不同，脂肪供能比也有所不同，30%～60%[11-13]均有报道。脂肪供能比10%为低脂饮食，30%～50%为HFD，而大于50%被认为是极高脂肪饮食。HFD的目的是让大鼠达到超重或肥胖状态，这与2型糖尿病患者大多伴有肥胖症状类似。HFD可以在不改变胰岛素受体亲和力的情况下导致胰岛素受体总体减少[14]，从而诱发胰岛素抵抗。但这并不意味着饲料脂肪比越高越好，高脂肪比饲料的成型与储存存在极大难度。除了脂肪比，肥胖的程度往往还取决于高脂喂养的周期。短期的高脂饮食（2周）往往达不到肥胖，只会导致胰岛素抵抗和（或）葡萄糖耐量减低，而相对较长的饮食（5周～3个月）会导致身体脂肪比例增高，这其中也包括内脏脂肪。HFD-STZ喂养的大鼠常常出现血脂代谢异常。多数大鼠在注射STZ之后，持续高脂饮食，后期大鼠通常会存在血脂异常；若给予STZ处理后，将高脂饮食替换为普通饮食的糖尿病大鼠，是否也依然存在血脂异常，需要进一步研究。且往往人类2型糖尿病发病常在肥胖、血脂紊乱、高胰岛素血症的基础上，出现血糖升高。因此，对STZ注射之前的血脂监测，将更有利于证明2型糖尿病大鼠发病过程。有研究认为高脂饮食的种类及喂养时间与STZ剂量密切相关[15]，即喂养时间越长，所需STZ剂量越少。

3 STZ

STZ是从无色链霉菌中提取的一种抗生素，本质上是一种氨基葡萄糖-亚硝基脲。由于它具有胰岛β细胞毒性被用于1型和2型糖尿病动物模型制备。其亚硝基脲部分是损伤胰岛β细胞的关键。研究发现STZ通过葡糖转运蛋白-2（GLUT-2）转运到细胞中，从而影响糖代谢水平，GLUT-2在肾脏、肝脏和小肠中也有表达，因此对这些器官也有一定程度的影响[16-17]。STZ通常被溶于生理盐水或柠檬酸钠缓冲液中（PH4.5），其水溶液极不稳定，一般在15～20分钟后降解，加之STZ具有光敏性，因此要求现配现用，避光，冰浴[18-19]。STZ常常采用腹腔（IP）或尾静脉注射（IV），IP操作更简便、快速，IV给药操作难度更大，但诱导的糖尿病模型也更稳定、重复性较好[20]。当给予IP时，应避免药物进入皮下或肠道，否则可能会增加死亡率或降低糖尿病的原发病作用。，而在同等条件下，IV所需STZ剂量更小。一般认为STZ剂量＞65 mg/kg为高剂量，40～55 mg/kg为中等剂量，＜35 mg/kg为低剂量[16]。 Gheibi等[21]以高脂喂养大鼠2周后单次腹腔注射STZ 30 mg/kg建立T2DM。Gomaa等[22]以高脂喂养大鼠4周单次腹腔注射STZ 25 mg/kg建立T2DM。Anupam等[23]以单次腹腔注射STZ 55 mg/kg建立Ⅰ型糖尿病（T1DM）。STZ的剂量对大鼠胰岛β细胞的残存量起到决定性的作用。临床研究在诊断T1DM时，患者通常60%～80%的胰岛β细胞功能丧失[24]，在诊断T2DM的15年后，β细胞数量减少了54%，这些数据表明，早期T1DM与晚期T2DM胰岛β细胞数量存在相似。T1DM与T2DM在疾病发展的不同阶段存在类似的病理表现，因此在用STZ诱导不同类型的糖尿病大鼠模型时，我们很难真正区分究竟是T1DM还是T2DM。T2DM的早期往往以胰岛素抵抗为主，一些方法如：糖耐量、胰岛素耐量及胰岛素抵抗的稳态模型（HOMA-IR）常常用来进一步验证T2DM大鼠模型，需注意的是STZ引起的糖尿病可能会导致胰岛敏感性的增加[25]，从而减轻胰岛素抵抗，这也许与大鼠机体代偿调节有关。综上所述，胰腺的病理状态也许对评价糖尿病模型鼠的类型及分期更为关键，但很少有研究提到这一参数。此外，大鼠空腹和非空腹状态可影响STZ的药效，有人建议STZ注射前禁食4 h[18]，也有人建议隔夜禁食[26]。禁食可增加胰岛细胞对STZ的敏感性。大鼠是夜间进食动物，夜间禁食，往往会导致禁食时间过长，禁食会激活多种生理反应，所以最好早上开始禁食[18]，大鼠的适宜禁食时间为7∶00～15∶00时之间的6～8 h。

4 鼠龄和体重

在绝大多数研究中，大鼠的鼠龄＜6个月，为年轻的糖尿病模型，而T2DM人群主要为老年人，而以青幼年的大鼠作为实验对象并不能很好地模拟临床上T2DM的疾病进程。使用鼠龄较大的鼠建造T2DM模型也同样存在巨大的挑战，鼠龄较大的鼠往往体重也更大，鼠龄相同的鼠，体重也不完全一致，不同的高脂饲料导致大鼠的体脂分布差异。Reed等[4]的研究表明，同样的STZ剂量给予不同体重的大鼠，这些大鼠并没有表现出相同的血糖水平。这可能与STZ不与脂质相互作用有关[27]。鼠龄小的大鼠尽管体重适宜，但它们有较强的胰岛β细胞代偿功能，能够通过增加β细胞的数量减轻甚至治愈糖尿病[28]。

研究结果显示：（1）高脂饲料的脂肪含量并不是越高越好，不同来源的大鼠对相同脂肪比含量的饲料适口性也不同，大鼠的进食量将对大鼠的体重起到决定性作用。大鼠在给予STZ后体重一般存在下降趋势，对于实验周期较长的研究者来说，基础体重过轻的大鼠在给予STZ后，往往不能够喂养至实验终点。（2）大鼠喂养的条件应基本一致，每笼的数量相当，一般一笼不要超过3只，鼠太多会存在抢食，导致体重差异较大，难以掌握STZ的剂量。尽管如此，即使保持相同的喂养条件，大鼠之间依然存在体重差异，因此在正式给予STZ之前最好能够挑选不同体重的大鼠进行预实验，将大大降低造模的死亡率。（3）造模成功的大鼠，尿量明显增加，保持垫料的干燥以及尾静脉测血糖后涂抹四环素软膏，将降低大鼠因感染引起的死亡率。（4）不同的糖尿病病程，选择的降糖药物也有所不同，在临床上这往往取决于胰岛β细胞的残余功能储备，因此检查大鼠的胰岛病理状态，有利于更深入的探究糖尿病的分期，有利于不同阶段药物的研究。