心脏代谢疾病生物标志物骨保护素的中西医研究进展

邓林华，陈善夫，李 娟，赵英强，柳 威

心血管疾病是人类死亡的主要原因之一，占全因死亡率的32%[1]。随着人口老龄化加剧，因心血管疾病的死亡人数不断升高，2020年心脏代谢疾病如动脉粥样硬化和糖尿病成为全球疾病负担的主要原因。因此，检测心血管疾病早期标志物并及时干预显得尤为重要。近年来，肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族在心血管疾病潜在生物标志物众多分子中受到极大关注，该家族成员包括骨保护素及其配体，他们是核转录因子κB(NF-κB)配体(RANKL)和TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)的受体激活剂。骨保护素/RANK/RANKL信号通路是调节骨形成和骨吸收平衡的关键，可诱导骨重建并调节破骨细胞分化和活化[2]。有研究显示，骨调节蛋白和血管生物学之间存在密切关系，血管钙化与骨重建是一种包括诱导和抑制的主动调节过程，血管钙化病人发生不良心血管事件风险较高[3]，且有证据表明，骨保护素在心脏代谢性疾病中作用可能是重要的[4]。

1 骨保护素和TNF相关凋亡诱导配体作为心脏代谢疾病生物标志物的结构和功能

1.1 骨保护素的结构和生物学功能 骨保护素最初是从人成纤维细胞培养基中纯化，且Tsuda等[5]将骨保护素描述为破骨细胞生成抑制因子(OCIF)，由于其具有抑制骨重吸收的能力称为骨保护素。骨保护素是TNF受体超家族的细胞因子，由TNFRSF11B基因编码，其包含7个结构域，结构域1～4富含半胱氨酸并与TNF受体细胞外结构域具有结构相似性，且足以消除破骨细胞生成；结构域5和6包含死亡结构域，其与Fas和TRAIL死亡受体具有相似性；结构域7是由50个氨基酸组成的，含有对二硫键形成和骨保护素二聚化必需的cys-400残基[6]，在骨保护素释放和活性调节方面发挥重要作用[7]。分泌骨保护素单体和二聚体形式之前，21a信号肽从N-末端切割，产生380aa成熟的骨保护素蛋白。循环骨保护素作为60 kD游离单体和120 kD二硫键连接的同型二聚体形式或作为与其配体RANKL和TRAIL结合的骨保护素形式存在。

骨保护素在体内由内皮细胞、血管平滑肌细胞(VSMC)和成骨细胞表达。骨保护素通过免疫组织化学在主动脉和冠状动脉粥样硬化斑块内或血管平滑肌细胞周围可检测到[8-9]。炎性因子、激素和各种循环化合物刺激时，内皮细胞在基础条件下释放骨保护素。炎性因子如TNF-α和白细胞介素(IL)-1β可增加骨保护素的表达水平。内皮细胞内骨保护素与Weibel-Palade体(WPB)分泌颗粒的血管性血友病因子(vWF)相关。vWF多聚体大小可通过糖蛋白血小板反应蛋白-1(TSP-1)控制。TSP-1从内质网内发挥作用，激活核因子E2相关因子2(Nrf2)，诱导针对脂毒性应激的保护性抗氧化防御反应[10]。有研究表明，骨保护素是脂肪干细胞(ASCs)释放的保护因子之一，有助于ASC介导的心脏保护作用[11]。虽然骨保护素介导的细胞保护机制尚未完全阐明，但已明确升高的骨保护素与炎症标志物、内皮功能障碍、氧化应激和心血管疾病密切相关[12]。

1.2 RANK/RANKL的结构和生物学功能 人类RANK是由616个氨基酸组成。这些氨基酸分为383个氨基酸的C末端细胞质结构域、184个氨基酸的N-末端细胞外结构域、28个氨基酸的信号肽和21个氨基酸的跨膜结构域，其包含4个半胱氨酸和2个N-糖基化位点，是一种在破骨细胞前体细胞上表达的1型同源三聚体跨膜蛋白。RANKL是一种在成熟成骨细胞上表达的2型同源三聚体跨膜蛋白，以可溶形式(sRANKL)在血液中循环。RANKL连接至RANK的下游信号传导的关键预备步骤是TNF受体相关因子(TRAF：2，5，6)与RANK细胞质结构域中特定位点结合，从而激活NF-κB激酶(IκB)/NF-κB和AP-1等相关信号通路。在内皮细胞的细胞核中，骨保护素与RANK/RANKL结合，通过NF-κB和AP-1诱导细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和血管细胞间黏附分子-1(VCAM-1)表达并促进白细胞黏附，这是内皮细胞功能障碍的早期表现。RANK-RANKL-骨保护素和其他调节蛋白是血管钙化进展的主要途径，骨保护素作为RANKL的诱饵受体，通过其N-末端富含半胱氨酸的结构域(CRD)与RANKL结合，从而阻止RANK/RANKL相互作用[13]。RANKL通过与RANK-TRAIL结合产生多个细胞内信号。

1.3 TRAIL的结构和生物学功能 TRAIL又称为Apo2L，是TNF相关的凋亡诱导配体，其负责外源性诱导细胞死亡。TRAIL表达为Ⅱ型跨膜蛋白，在生理学方面以生物活性的可溶性三聚体形式存在，结构方面与CD95L和TNF相关。人类TRAIL包括4种跨膜受体：死亡受体4(DR4，TRAIL-R1)、DR5(TRAIL-R2)、诱饵受体1(DcR1，TRAIL-R3)、DcR2(TRAIL-R4)，第5种是骨保护素。TRAIL/TRAIL-R系统的重要作用是调节细胞凋亡。DR4属于TNFR超基因家族，含有细胞质死亡域，其诱导细胞凋亡的过程独立于CD95、TNFR1或FADD发挥作用。骨保护素与TRAIL结合，与TRAIL相互作用并通过肿瘤坏死因子受体超家族成员(TNFRSF)家族中的细胞表面受体死亡受体4(DR4)和DR5抑制肿瘤细胞凋亡[14]。小鼠TRAIL有一个全长受体TRAIL-R(mDR5、mTRAILR2)，与人类DR4和DR5相同。TRAIL与特定死亡受体结合导致另一种形式程序性细胞死亡，称为坏死性凋亡，其作为病毒防御机制发挥重要作用，细胞以不依赖于Caspase方式进行细胞死亡。

TRAIL及其相关受体分布于广泛的组织中，包括脾、肺和前列腺等，并由多种细胞类型表达，包括血管细胞、免疫细胞和脂肪细胞。虽然最初认为仅在恶性或转化细胞中诱导细胞凋亡，但已知TRAIL结合不同的受体以激活信号传导途径，包括NF-κB、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)、细胞外调节蛋白激酶(ERK1/ERK2)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和p38等，并在非转化细胞中发挥多效作用。TRAIL在动脉粥样硬化病变中表达，易损斑块位点可见其表达水平升高。有研究证实，TRAIL处理的内皮细胞中细胞凋亡增加，而其他组织已显示相应TRAIL的这些细胞存活和增殖增加，似乎TRAIL在脉管系统内具有多效性，既导致动脉粥样硬化发生，又存在血管保护的双重作用[15]。相关研究表明，可溶性TRAIL诱导一些信号转导途径的激活，促进VSMCs和内皮细胞存活，通过其抗炎特性和局部一氧化氮(NO)产生进而发挥内皮保护作用[16]。

2 骨保护素在心血管疾病中的作用

2.1 保护内皮功能、抗炎、抗凋亡 内皮是分布不均匀的器官之一。相关研究表明，内皮可能是破坏性致命疾病的起源[17]。内皮包括大量不同表型、功能和位置的内皮细胞亚型，他们具有损伤和/或病理情况(如缺氧或组织损伤)诱导的血管生成因子，形成新的脉管系统能力。内皮细胞代谢活性不同于其他细胞的代谢活性，其细胞生物能量学与氧化线粒体代谢相关。内皮细胞可改变其表型并在不状态之间转换-迁移、增殖和静止。内皮细胞通过有氧糖酵解产生高达85%的三磷酸腺苷(ATP)。不同内皮细胞亚型的糖酵解速率不同。动脉内皮细胞更具氧化性，而微血管内皮细胞糖酵解能力更强。脂肪酸-β-氧化(FAO)分解代谢的脂肪酸(FAs)是胚芽发育过程中内皮细胞的重要物质[18]。高FA可激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-α)，从而增加FAO。心肌细胞中，约70%的ATP由FA氧化产生，FA是主要的能量来源，在这种情况下，内皮细胞发挥关键作用。内皮衰老可能在心脏肥大等疾病中发挥重要作用，并在这种状态下导致葡萄糖代谢增加，FAO减少。内皮细胞和心肌细胞之间存在干扰，代谢适应不良可能损害心脏功能。ATP/腺苷代谢与骨保护素/RANK/RANKL三联体的功能之间存在密切联系，人骨祖细胞系研究显示，腺苷和腺苷受体激动剂抑制骨保护素分泌[19]。体外采用骨保护素处理内皮细胞诱导内皮集落形成细胞(ECFC)的细胞骨架重组。整联蛋白αvβ3和/或αvβ5有助于骨保护素诱导的内皮细胞增殖和迁移，同时施用这些抗体时，骨保护素诱导增殖受到抑制。骨保护素诱发细胞外信号调节激酶(ERK)1/2的激活，其与整合素αv活性相关[20]。除细胞迁移中的作用外，αvβ3整合素促进刺激内皮细胞存活。这种情况下，硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)可调节骨保护素生物利用度，骨保护素可能通过HSPGs/黏结合蛋白多糖-1(syndenan-1)结合进而与ENFC相互作用[21]。另有研究表明，骨保护素通过αvβ3整合素防止人微血管内皮细胞(HMVENs)TRAIL诱导的细胞凋亡[22]。血管紧张素Ⅱ泵入的骨保护素基因敲除小鼠腹腔注射骨保护素，改善心力衰竭进展而不影响收缩压水平，说明骨保护素在血管紧张素Ⅱ诱导的心脏肥大过程中保持心肌结构和功能的生物活性，可能具有抗细胞凋亡和促纤维化作用[23]。S-氨氯地平可能通过调节RANK/RANKL/骨保护素途径抑制炎症并防止内皮功能障碍，RANK/RANKL/骨保护素途径可能是miR-155的下游[24]。

2.2 改善脂质代谢，保护钙化血管 RANKL、RANK和骨保护素等因素通过改善脂质代谢参与动脉粥样硬化的过程。骨保护素基因敲除小鼠中钙化动脉与骨质疏松症发展首先揭示骨保护素在血管生物学中的作用，且积累证据支持骨保护素对钙化的保护作用[25]。已有研究表明，编码骨保护素的TNFRSF11B基因多态性与类风湿性关节炎病人冠状动脉粥样硬化有关[26]。骨保护素显示在载脂蛋白E(ApoE)-/-小鼠无名动脉晚期动脉粥样硬化病变的进展和钙化中具有保护作用，关于ApoE和骨保护素双重缺乏的老年小鼠发展为复杂的动脉粥样硬化病变[27]。主动脉瓣狭窄中，瓣膜高密度脂蛋白(HDL)减少。HDL均诱导骨保护素分泌，并在体外降低TNF-α表达[28]。生长因子系统包括VEGF和血小板衍生生长因子(PDGF)，通过内分泌和自分泌/旁分泌机制在脉管系统细胞中发挥作用，这些因子的内皮作用机制是多重的，并已显示其参与动脉粥样硬化的发生和发展。有研究显示，血管细胞中PDGF可上调VSMC中骨保护素表达，而PI3K/Akt信号通路消除了PDGF诱导的骨保护素表达[29]。

3 骨保护素在心血管疾病中的临床研究

心力衰竭病人与无心力衰竭受试者相比，RANKL(T细胞和血清)和骨保护素(血清)表达增加，表明RANKL表达增加可能是导致左室功能障碍的潜在机制，而骨保护素表达增加可能有助于防止RANKL的有害作用[30]。无症状受试者血清RANKL、基质金属蛋白酶8(MMP-8)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)水平与冠状动脉钙化评分(CCS)呈正相关，反映循环RANKL与冠状动脉钙化之间的潜在关系，血清RANKL水平可能代表冠状动脉钙化和相关心血管风险的潜在生物标志物[31]。一项前瞻性队列研究显示，骨保护素与年龄、吸烟、流行性糖尿病、C-反应蛋白、性激素结合球蛋白及尿酸等密切相关，女性骨保护素与高血压和胎球蛋白-A呈正相关，此外，骨保护素与氨基末端脑钠肽前体(NT-proBNP)之间存在联系[32]。相关研究显示，骨保护素和TRAIL水平与心房颤动事件及潜在心血管风险显著相关，急性心房颤动病人初始TRAIL水平与左室射血分数呈正相关，与左心房直径呈负相关；根据CHA2DS2-VASc评分选择的亚组中骨保护素增加；窦性心律维持的亚组TRAIL浓度明显增加；在预测心房颤动发生具有较好的预后价值[33]。高血压病人骨保护素水平升高，血浆骨保护素和骨桥蛋白(OPN)水平与炎症和高血压显著相关[34]，骨保护素与高血压病人慢性肾病密切相关[35]。血脂异常和糖尿病均可影响心血管系统骨保护素/TRAIL比值，而这些变化促进动脉粥样硬化发展和心脏重塑[36]。有研究表明，骨保护素通过增加蛋白多糖和基质金属蛋白酶(MMPs)水平干扰正确的瓣膜内皮功能[37]，骨保护素参与二尖瓣脱垂(MVP)分离细胞和分子变化，MVP病人循环骨保护素水平升高，表明骨保护素可能参与MVP发展和进展。骨保护素血管钙化方面作用仍存在争议，另有研究表明，冠状动脉疾病和慢性肾病病人血清骨保护素浓度似乎对钙化无明显影响[38]。

3 中医药通过调控骨保护素治疗心血管疾病

已有研究表明，中医药通过调控骨保护素/RANK/RANKL信号通路抑制破骨细胞生成进而发挥骨保护作用[39]。骨保护素与心血管疾病人群存在密切关联已被多项研究证实，但关于中医药通过调控骨保护素相关信号转导从而发挥心血管保护作用研究较少。有研究表明，黄连素可抑制高级糖基化终产物(AGEs)诱导的人主动脉平滑肌细胞(HASMCs)钙化，其机制可能与下调ERK、p38丝MAPK信号通路导致OPG、OPN、骨形态发生蛋白2(BMP2)表达减少有关[40]。补肾活血汤对抑制由高水平磷酸盐诱导的VSMC成骨分化具有有益作用，潜在机制可能与VSMC成骨分化过程中上调骨保护素mRNA表达并下调RANKL mRNA表达作用有关，从而阻止VSMCs表型变化为成骨表型[41]。小檗碱可能通过抑制碱性磷酸酶(ALP)和BMP-2通路中BMP-2、骨保护素、骨钙素(OCN)和与侏儒相关的转录因子2(RUNX2)因子缓解血管钙化，从而间接发挥缓解动脉粥样硬化作用[42]。桑叶水提取物治疗糖尿病大鼠可上调骨保护素表达，下调AGEs、晚期糖基化终产物(RAGE)、NADPH氧化酶4(Nox4)、NF-κB和RANKL表达，从而改善骨的微观结构和强度，并通过调节AGEs/RAGE/Nox4/NF-κB信号传导消除氧化应激[43]。

4 小 结

骨保护素作为一种新型的生物标志物，临床试验已明确是急性冠脉综合征病人心力衰竭发展和死亡率的独立预测因子，与心脏病进展和严重程度有关[44]。虽然已建议将血清骨保护素和sRANKL水平作为各种心血管和代谢疾病血管风险和预后的生物标志物，但研究结果[44-45]不一致。骨保护素从血管内皮细胞持续释放以响应炎性蛋白和细胞因子，表明骨保护素在血管损伤、炎症和止血中起调节作用。因此，骨保护素可能作为早期内皮功能障碍的潜在生物标志物[46-47]，由血管损伤引起的骨保护素水平升高发挥内皮保护机制作用，可改善心血管疾病病人预后。但目前尚不明确骨保护素是否可调节或保护心血管代谢疾病，中医药领域相关研究较少，骨保护素作为预测心血管疾病风险的新型标志物有待于更多的中医药临床及基础研究加以证实。