二氮嗪对氧糖剥夺后BV-2细胞凋亡及caspase-3表达的影响

2020-01-09付昱李昕韩冬郭靖宇王艺霖张鸿

中国医科大学学报 2020年1期

付昱，李昕，韩冬，郭靖宇，王艺霖，张鸿

（中国医科大学附属盛京医院神经内科，沈阳 110004）

ATP敏感性钾通道（ATP-sensitive potassium channels，KATP）开放剂可以对脑缺血/再灌注损伤中的神经元及血脑屏障相关蛋白发挥保护作用［1-2］，但对于小胶质细胞的作用及相关信号通路仍不清楚。二氮嗪是一种线粒体KATP开放剂，研究［2］表明二氮嗪可以在大鼠脑缺血/再灌注模型中对神经细胞及血脑屏障相关蛋白起保护作用。BV-2细胞是小鼠小胶质细胞，常用作小胶质细胞模型，用无糖血清和三气培养箱创造氧糖剥夺条件对BV-2细胞进行处理，可模拟缺血缺氧状态下的细胞微环境。本研究拟通过氧糖剥夺诱导的BV-2细胞探讨二氮嗪对缺血缺氧状态下小胶质细胞的影响。

1 材料与方法

1.1 主要仪器及试剂

HERA Cell 150 三气培养箱（美国 Billups-Rothenberg 公司），FACScalibur流式细胞检测分析仪（美国 BD 公司），Eclipse NI正置荧光显微镜+图像采集系统（日本尼康公司），RPMI1640培养基、新生胎牛血清、无糖DMEM培养基（美国Gibco公司），AV/PI凋亡试剂盒（苏州宇恒生物科技有限公司），caspase-3抗体、FITC标记二抗（美国Proteintech Group公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：小胶质细胞系BV-2细胞用含有20%胎牛血清的RPMI1640完全培养基在37 ℃、5%CO2培养箱中培养，每48 h更换培养基1次。

1.2.2 分组建模及给药：将4个培养皿的BV-2细胞传代2 d后，分为A、B、C、D 4组。A组为对照组；B组更换为无糖无血清培养基并移至HERA Cell 150 三气培养箱中进行氧糖剥夺建模，持续充以10%CO2和90%N2，在此条件下培养6 h后复氧，更换为常氧、原培养液条件下再培养24 h；C组在氧糖剥夺处理之前给予二氮嗪100 μmol/L；D组在氧糖剥夺处理之前给予二氮嗪100 μmol/L+5-羟葵酸（5-hydroxydecanoate，5-HD）100 μmol/L。

1.2.3 流式细胞术检测BV-2细胞的凋亡：用含0.25%EDTA的胰酶对BV-2细胞进行消化处理，每样本细胞数在1×105～5×105范围内，收集细胞后在高速冷冻离心机中以300g离心5 min，弃去上清培养液。加入PBS 500 μL洗涤2次，再以300g离心5 min。弃去上清培养液后，加入100 μL流式缓冲液进行重悬，采用AnnexinV-FITC/PI双染法，每管先加入5 μL AnnexinV-FITC，混匀后再加入2 μL PI工作液振荡混匀，所有操作均在冰上进行。于室温下避光孵育15 min，1 h内上流式细胞仪检测。

1.2.4 免疫细胞荧光染色检测cleaved caspase-3蛋白表达：待培养皿中的BV-2细胞培养至对数生长期，以104/孔铺于6孔板，待细胞生长至镜下视野的70%～80%，PBS洗3次，每次3 min。用4%多聚甲醛在-20 ℃固定20 min，PBS洗3次，每次3 min。5%BSA室温封闭1 h。加入caspase-3一抗（稀释1 ∶100），在湿盒中4 ℃过夜。PBS洗3次，每次3 min。加二抗（PBS稀释1 ∶100），室温避光孵育4 h，PBS洗3次，每次3 min。加入DAPI染色剂200 μL，室温避光孵育5 min。PBS洗4次，每次5 min。加入50 μL抗荧光淬灭剂封片，利用荧光显微镜观察蛋白定位并测定蛋白平均光密度值（IOD）。

1.2.5 免疫印迹实验检测cleaved caspase-3蛋白表达情况：收集BV-2细胞至EP管，用RIPA提取总蛋白，BCA蛋白定量，高温变性。各组取40 g蛋白行10%SDS-PAGE凝胶电泳，110 V、86 mA恒压转印至PVDF膜。5 %脱脂奶粉常温封闭2 h。加入一抗（anti-cleaved caspase-3 稀释1 ∶1 000及anti-β-actin 稀释1 ∶5 000）4 ℃摇床过夜。加入二抗（1 ∶200与HRP2结合）孵育2 h，ECL染色，凝胶图像分析仪扫描图像，用Image J软件分析蛋白条带灰度，计算目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各组BV-2细胞凋亡情况

流式细胞术结果显示，B、C、D组凋亡率均有升高，与A组比较差异均有统计学意义（P＜0.01）；B、D组凋亡率升高较C组显著，差异有统计学意义（P＜0.01），B组和D组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1。

2.2 cleaved caspase-3蛋白的表达情况

免疫荧光染色和免疫印迹检测结果显示，4组细胞内均可见cleaved caspase-3蛋白表达。B、C、D组表达均高于A组，但C组低于B、D组，差异均有统计学意义（均P＜0.01）），B组和D组比较无统计学差异（P＞0.05）。见图2～3。

3 讨论

卒中是全球成人致死致残的主要病因，随着我国经济水平不断提高，卒中已逐步成为我国仅次于心脏疾病和肿瘤的第三大致死病因。虽然对于卒中发生的分子和细胞机制的了解越来越深入，但是目前仍然没有非常有效的治疗药物。

图1 各组BV-2细胞凋亡率Fig.1 Apoptosis rate of BV-2 cells in different groups

图2 各组BV-2细胞cleaved caspase-3蛋白的表达（免疫荧光染色）Fig.2 Expression of cleaved caspase-3 protein in different groups（immunafluorescence）

脑内的神经元、星形胶质细胞、血管内皮细胞、细胞外基质、周细胞以及小胶质细胞等组成神经血管单元［3］。神经血管单元中的小胶质细胞作为“中枢神经系统的巨噬细胞”，在神经系统疾病中的作用一直为众多学者所关注［4-6］，特别是小胶质细胞在脑缺血/再灌注损伤中的反应，被作为一个重要的治疗靶点加以研究［7-8］。前期研究［9-11］显示，KATP开放剂吡那地尔能够明显减轻大鼠脑缺血/再灌注后的神经功能损伤，减小梗死区体积，并通过激活PI3K/Akt/Bcl-2通路，影响神经细胞的凋亡，以此对脑组织起到保护作用。

多项研究［12-13］表明，KATP开放剂二氮嗪能够降低病理条件下的神经元PC12细胞的凋亡率。也有文献［14］报道有药物能够减少氧糖剥夺后BV-2小胶质细胞炎性细胞因子的释放以及凋亡的发生，但KATP开放剂二氮嗪对氧糖剥夺后小胶质细胞的作用仍不清楚。本研究使用流式细胞术和AnnexinV-FITC/PI双染法检测了小胶质细胞系BV-2细胞的凋亡率，结果发现二氮嗪可以减少氧糖剥夺/复氧后的BV-2细胞的凋亡。caspase-3蛋白是细胞凋亡的重要相关蛋白，通常被活化剪切为P17与P12 2种片段，引起凋亡发生［15-16］。本研究结果表明，二氮嗪能减少缺氧/复氧后BV-2细胞中caspase-3的活化，而5-HD作为一种KATP阻断剂能降低二氮嗪对caspase-3的活化。证明KATP开放剂有可能是通过减少caspase-3蛋白的活化而发挥其对缺氧/复氧后的小胶质细胞的保护作用。