稀少精子冷冻复苏并行补救性睾丸显微取精ICSI 一例报告

孙健，梁齐，阳娟，黄卫东

(新疆佳音医院生殖医学中心，乌鲁木齐 830000)

一、病例资料

患者夫妇因不孕症来新疆佳音医院就诊。女方27岁，双侧输卵管通而不畅，宫颈正常，子宫形态正常，内壁不光整，粘膜呈粉红色，可见小息肉，在我院给予摘除；无传染病史；2018年曾行腹部巨细胞瘤手术，现已治愈；无不良嗜好，月经正常。男方29岁，无传染病及手术史，亦无不良嗜好；男科检查前列腺及睾丸均未见异常；精液检查结果为高倍镜下偶见活动精子，诊断为严重少弱精子症。夫妻双方染色体检查均正常。女方促排方案为长效长方案，取卵当日共获卵19枚，其中MⅡ卵13枚、MⅠ卵3枚和GV卵3枚。

为避免取卵当日无精子可用，男方于女方取卵前将精子冷冻。男方禁欲时间5 d，手淫取精，精液液化后偶见极少量活动精子，告知患者精液解冻后可能出现的不良结果并签署知情同意书后将精子冷冻。取卵当日患者先手淫取精，精液中未见可用精子。告知患者后解冻冻存精液，镜下找到可用精子7个并行卵胞浆内单精子注射(ICSI)卵子7枚。告知患者剩余6枚MⅡ卵子可选择冷冻保存，也可以选择睾丸显微取精术取精后行ICSI，患者同意手术取精并签署知情同意书，行睾丸显微取精术，剥离组织后镜下可见活动精子，镜下选择6个精子对剩余6枚MⅡ卵子行ICSI。

采用解冻精子行ICSI共获得受精卵6枚(Ⅰ级胚胎3枚、Ⅱ级胚胎2枚、Ⅲ级胚胎1枚)，睾丸精子行ICSI共获得受精卵3枚(Ⅱ级胚胎1枚、Ⅲ级胚胎2枚)。女方因预防卵巢过度刺激综合征在第3日未进行鲜胚移植，冷冻Ⅰ级胚胎2枚，剩余胚胎培养至囊胚。其中解冻精子受精胚胎第5天形成4BB囊胚1枚，第6天形成3CC囊胚1枚；睾丸精子受精胚胎第6天形成5CB囊胚1枚。其中4BB囊胚冷冻保存。

2019年7月解冻复苏4BB囊胚1枚后移植，移植后血HCG值测定为2.34 U/L，妊娠失败。2019年10月解冻复苏Ⅰ级D3卵裂胚2枚并移植，移植后血HCG值测定392.2 U/L，B超显示为单胎妊娠，胎心胎芽均可见。

二、讨论

无论是育龄阶段的男性和女性，还是未来可能面临生育力受损的青春期前的男孩和女孩，生育力保存都是一个根本问题[1]。成年男性患者生育力保存最简便有效的方法是冻存精液中的精子，当精液中有一定量的活精子时，首选精液冷冻保存[2]。精液冷冻对于男性不育治疗非常重要，特别是对于少精子症和无精子症患者，因为这意味着患者在以后长期连续治疗中都有精子可供使用[3]。虽然精子冷冻保存技术已经开展了多年，但对于微量精子的冷冻而言，常规的精子冷冻方法仍是不可靠的[4]。随着冷冻技术的不断发展，人们发明了针对微量精子的玻璃化冷冻技术[5]、透明质酸微囊等新的冷冻载体[6]、提高了医生对不活动精子冷冻价值的正确判断[7]，丰富了医生的诊疗技术、扩大了患者的选择空间。Wang等[8]利用改良后的载体Cryoplus冷冻少精子症患者的精子，在ICSI周期中，可以获得和新鲜精子相近的受精率和优质胚胎率。Berkovitz等[9]则提供了一种新的可用于小体积液滴精子冷冻的载体——SpermVD，复苏后的精子回收率达96%，并且能缩短复苏后寻找精子的时间。本病例中使用的精子冷冻保存载体为超微量麦管，Liu等[10]认为超微量麦管的冷冻降温速率明显快于0.25 ml麦管和0.5 ml麦管，通过快速的热传导减少冰晶形成，改善精子活力，使解冻后精子的正常形态比例、顶体和DNA完整率更高。超微量冷冻麦管在18个ICSI周期中，临床妊娠率和累积活产率分别达到52.5%和55.6%，是一种可用于微量精子冷冻保存的安全有效的新载体[11]。

本病例中，男方患严重的少弱精子症，为避免取卵当日无精子可用，提前冷冻了精液。取卵当日取精后，精液中无可用精子，解冻精液后仍未获得足够的精子进行受精。在告知患者后，患者同意进行睾丸显微取精，并用获得的精子完成剩余成熟卵子的受精。本病例提示在微量精子冷冻解冻过程中，不能忽视冷冻解冻过程中可用精子损失的风险。Kathrins等[12]回顾了83个射精或睾丸精子冷冻保存复苏ICSI周期，在睾丸精子样本中，复苏后发生完全细胞丢失的比例是5.8%，在射精精子样本中，复苏后发生完全细胞丢失的比例是7.1%，其认为虽然细胞丢失是罕见事件，但对于患者尤其是对于手术取精的患者要充分知情同意。本病例中，患者在精液冷冻、复苏、手术取精过程中被充分告知了相关风险，患者也充分理解治疗过程中可能存在的突发情况，最终完成了整个治疗过程，未发生医疗纠纷。

本病例中，患者形成的胚胎分别来自于冷冻复苏精子和睾丸显微取精的精子，冷冻复苏虽然导致精子DNA损伤[13]，并影响与精子运动能力、活力、顶体完整性相关的蛋白表达[14]，但复苏后的精子行ICSI得到的胚胎质量好于睾丸取精行ICSI后的胚胎，患者移植的细胞胚和囊胚均来源于冷冻复苏后的精子，并最终妊娠成功。胚胎质量和妊娠结局是否会受到精子来源的影响，有研究者认为经过冷冻的睾丸精子不会影响ICSI结果[15-16]，也有研究者认为精子的来源会影响受精率[17]，因为精子成熟度、活力和浓度会影响受精率。本病例中，患者手淫取精未获得可用精子，在解冻精子不足以完成ICSI的情况下通过显微取精获得精子完成受精。在解冻后具有一定活动能力且形态正常的精子被优先选择注入卵子受精，而睾丸手术取得的精子，其活动能力非常弱，多为抖动或微微颤动，且精子成熟度不如射精精子，可能是影响胚胎发育的因素。本文为单病例报道，胚胎数较少，这种差异也可能只是个别现象。

综上所述，对于严重少弱精子症、隐匿性无精子症及手术取精的患者，精子冷冻保存是保存生育力的策略之一，但不能忽视冷冻复苏之后无精子用的风险，并要将相关风险告知患者，以保证患者权益，避免医疗纠纷的发生。