溶瘤腺病毒治疗肾癌的研究进展

2020-01-08王宗平王华

浙江医学 2020年2期

王宗平王华

在肾恶性肿瘤中，约90%为肾细胞癌（RCC）；RCC约占成人恶性肿瘤的3%。多数RCC是检查中偶然发现且为早期诊断，但仍有30%的患者就诊时已出现转移[1]。根治性肾切除术或肾部分切除术是治疗局限性RCC的金标准，但约30%的患者治疗后会出现局部复发或远处转移。对于转移性RCC（mRCC），目前尚缺乏有效的治疗方法，预后较差。近年来研究发现，溶瘤腺病毒对肾癌具有良好的抗肿瘤效果及安全性，以溶瘤腺病毒为载体的肾癌基因治疗也有广阔的应用前景。本文就瘤腺病毒治疗肾癌的研究进展作一综述。

1 肾癌治疗现状

RCC对放化疗多不敏感，细胞因子疗法如干扰素或白细胞介素作为mRCC的标准治疗方法沿用多年，但其有效率不足20%。近年来，分子靶向药物如血管内皮生长因子受体（VEGFR）抑制剂（舒尼替尼、索拉非尼、帕唑帕尼、阿西替尼等）以及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）抑制剂（替西罗莫司、依维莫司）广泛应用于mRCC的治疗。但靶向药物对mRCC的客观反应率为10%～30%，完全缓解率不足1%，最终患者出现疾病进展甚至死亡[2]。2014年美国临床肿瘤学会会议报道了mRCC的最新免疫疗法——程序性死亡分子-1（PD-1）抑制剂，临床Ⅱ期试验结果显示其客观反应率达到54%[3]，但缺乏长期的随访数据。因此，研发治疗mRCC的新疗法很重要。

2 溶瘤腺病毒选择性复制机制

溶瘤腺病毒作为一种新型抗肿瘤制剂，治疗肿瘤的应用前景被逐渐重视。经过基因修饰的腺病毒可选择性地在肿瘤细胞中复制并裂解肿瘤细胞，而正常细胞不受影响。肿瘤细胞裂解释放出更多的腺病毒，可再次感染临近的组织细胞，直至肿瘤被完全破坏，从而达到治疗肿瘤的目的。因此，溶瘤腺病毒的肿瘤特异性复制是其最重要的特性，同时也是该治疗手段安全性的关键所在，而达到这一特性需要合理的基因修饰。目前已知2种基因修饰方法，具体介绍如下[4]。

一种方法是通过基因突变，改变腺病毒蛋白的表达，从而限制腺病毒在正常细胞内的复制。腺病毒的复制需要细胞周期进入S期，腺病毒感染细胞后，其早期蛋白E1A与宿主细胞的Rb蛋白结合，激活E2F转录因子，迫使细胞周期进入S期，为腺病毒的复制提供良好的环境。但随着E2F的激活，p53也被激活。p53蛋白使细胞周期阻止在G1期或诱导细胞凋亡，从而限制腺病毒的复制。然而，腺病毒的E1B55KD蛋白可以结合并使p53蛋白失活，最终使细胞周期进入S期，从而使腺病毒能够在宿主细胞内复制。通过对腺病毒的基因修饰，使编码E1A蛋白和（或）E1B55KD蛋白的基因发生突变，消除病毒蛋白与Rb蛋白和（或）p53蛋白的结合能力，从而限制腺病毒在正常细胞内的复制。进展期RCC常具有多个细胞周期调控相关的基因突变，包括p53、Rb等，而细胞周期的失控利于溶瘤腺病毒在肾癌细胞中的复制，因此溶瘤腺病毒可作为晚期肾癌的靶向治疗手段。

另一种方法是在病毒基因中插入肿瘤或组织特异性启动子，使腺病毒仅在能表达该种特异性蛋白的肿瘤细胞或特定组织细胞中选择性复制。肿瘤细胞常高表达某些生物分子，而正常细胞低表达或不表达；相比于正常细胞，肿瘤细胞存在一定的特异性。肾癌组织中高表达人端粒酶逆转录酶（hTERT）、核抗原Ki-67、细胞表面抗原G250、趋化因子受体（CXCR4）等。将肿瘤特异性生物分子的启动子基因插入腺病毒的基因区，从上游调控腺病毒的基因表达，致使腺病毒在表达这些特异性生物分子的肾癌细胞中复制；由于正常组织中启动子处于静默状态，无法驱动腺病毒的复制，从而达到肿瘤靶向性感染[5]。

3 溶瘤腺病毒治疗肾癌的临床前研究

3.1 E1A或E1B基因突变的溶瘤腺病毒第一代溶瘤腺病毒是dl1520（ONYX-015），该病毒删除了E1B55KD基因，丧失了与宿主细胞p53蛋白的结合能力，能选择性地在p53基因突变的肿瘤细胞内复制并破坏肿瘤细胞，而在正常细胞内不能复制[6]。随后，E1A突变的腺病毒dl922-947和△24显示了对Rb传导途径异常的肿瘤具有肿瘤选择性复制和杀伤效果。但后期研究表明，E1A或E1B单一突变的腺病毒在正常细胞内仍有一定程度的复制。为了进一步限制腺病毒在正常细胞内的复制，E1A、E1B双突变溶瘤腺病毒AxdAdB-3和CB1相继被报道，这两种病毒都具有E1B55KD缺失、E1A的Rb结合位点突变，消除了腺病毒与p53和Rb蛋白结合的能力，理论上在p53功能异常和（或）Rb传导途径异常的肿瘤内均可复制，对正常细胞更安全，对肿瘤细胞更具杀伤效果[7]。

前期研究报道了E1A、E1B双突变溶瘤腺病毒AxdAdB-3治疗肾癌的研究，结果显示AxdAdB-3能有效感染并杀伤表达腺病毒受体（CAR）的肾癌细胞株，但在CAR不表达的肾癌细胞株（T0S-1、ACHN）中的细胞杀伤效果较弱，且该病毒不会在正常肾细胞株（RPTEC）中复制[8]。腺病毒感染细胞首先是由病毒纤维蛋白与细胞表面CAR结合，然后腺病毒蛋白的Arg-Gly-Asp（RGD）肽链结构与细胞的 αvβ3、αvβ5 整合素结合，从而使腺病毒进入细胞内。研究表明，腺病毒对宿主细胞的感染效率与CAR表达水平密切相关。而许多恶性肿瘤（包括进展期肾癌）缺乏CAR表达，从而限制了溶瘤腺病毒的应用。Haviv等[9]发现肾癌细胞缺乏CAR表达而高表达整合素αvβ3和αvβ5，故采用RGD修饰的E1A突变溶瘤腺病毒治疗肾癌，结果显示RGD修饰的溶瘤腺病毒对CAR阳性和阴性的肾癌细胞株均具有较强的细胞杀伤效果。

3.2 组织特异性启动子调控的溶瘤腺病毒将肿瘤组织特异性表达的生物分子的启动子基因插入腺病毒基因区，可作为溶瘤腺病毒靶向治疗肾癌的另一种策略。与前列腺癌、肝癌等恶性肿瘤不同，RCC缺乏以区分其他肿瘤的高度特异性生物分子，目前研究常采用多数肿瘤共同表达的肿瘤特异性生物分子作为溶瘤腺病毒的启动子，如hTERT、Ki-67、G250、CXCR4等。多项研究表明，插入启动子的溶瘤腺病毒可选择性感染肾癌细胞。以CXCR4为例，趋化因子及其受体SDF-1a/CXCR4与乳腺癌[10]、前列腺癌[11]、卵巢癌[12]等多种肿瘤的转移及局部进展相关。已有研究表明，CXCR4在部分类型的肾癌细胞中高表达[13-14]。Haviv 等[15]研究发现，A498、CAKI-1、SN12C肾癌细胞株高表达CXCR4，KU-19-20肾癌细胞株低表达，而786-0肾癌细胞株及正常组织细胞不表达CXCR4。将插入CXCR4启动子的溶瘤腺病毒AdGL3BC－XCR4感染这些细胞株，结果显示在CXCR4高表达的细胞株中CXCR4启动子的活性明显高于低表达或不表达CXCR4的细胞株；这说明插入CXCR4启动子的溶瘤腺病毒可特异性感染CXCR4高表达的肾癌细胞[15]。

3.3 以溶瘤腺病毒为载体的肾癌基因治疗 RNA干扰技术可以特异性敲除特定基因的表达，在恶性肿瘤的治疗上具有较好的前景；但是siRNA半衰期较短及质粒的转染率较低，从而限制了其应用。研究者将干扰RNA与溶瘤腺病毒连接，利用溶瘤腺病毒肿瘤选择性复制的特点，将干扰RNA转染至肿瘤细胞，可达到溶瘤及基因治疗的双重效果。

Ki-67是一种细胞核抗原，与细胞增殖有关。增殖活跃的细胞，尤其是恶性肿瘤细胞高表达Ki-67，而静止期的细胞不表达Ki-67。研究表明，抑制Ki-67的表达可明显抑制肿瘤细胞的增殖[16]。Zheng等[17]将Ki-67-shRNA连接至腺病毒的基因区，构建了能调控表达Ki-67干扰RNA的溶瘤腺病毒ZD55-Ki-67。采用ZD55-Ki-67分别感染肾细胞株786-0、ACHN及正常肾小管细胞株HK-2，并与表达增强型绿色荧光蛋白的腺病毒ZD55-EGFP、复制缺陷型（E1区缺失）腺病毒Ad-EGFP、Ad-Ki-67进行比较；结果显示ZD55-Ki-67、Ad-Ki-67感染的肾癌细胞中Ki-67的表达明显下调，ZD55-Ki-67的细胞杀伤效果是ZD55-EGFP的10倍，是Ad-Ki-67的1 000倍；在裸鼠实验中，ZD55-Ki-67的缩瘤效果更明显，显示了ZD55-Ki-67对肾癌组织的高度特异性及更强的细胞杀伤效果。另外，4种腺病毒均未对正常肾小管细胞株产生明显的细胞杀伤作用。Cui等[18]一项研究将hTERT干扰RNA与腺病毒重组，同样显示了较好的应用前景。肿瘤细胞的繁殖与端粒酶活性增强密切相关，而hTERT是人端粒酶活性的决定性调控因子。研究证实，hTERT在恶性肿瘤组织中高表达，在正常组织中不表达。Zheng等[19]采用类似的方法，将hTERT-shRNA插入至腺病毒ZD55的E1B基因区，形成具有表达hTERT干扰RNA的溶瘤腺病毒ZD55-hTERT。经体外细胞及裸鼠实验，他们发现ZD55-hTERT不仅明显下调hTERT的表达，抑制端粒酶的活性，而且在肾癌细胞的杀伤及缩瘤效果上也更具优势。Fang等[20]重组了携带Ki-67启动子并调控表达Ki-67与hTERT双干扰RNA的融瘤腺病毒Ki-67-ZXC2-double siRNA，结果发现正常细胞株HK-2不表达Ki-67，而3种肾癌细胞株KETR-3、786-O、ACHN不同程度表达Ki-67；蛋白免疫印迹法检测提示感染腺病毒后，3种肾癌细胞均表达E1A蛋白，而正常细胞不表达，显示了携带Ki-67启动子的溶瘤腺病毒的高度肿瘤特异性复制。Ki-67-ZXC2-double siRNA的细胞杀伤效果明显强于 Ki-67-ZXC2-Ki-67 siRNA、Ki-67-ZXC2-hTERT siRNA、Ki-67-ZXC2。

3.4 溶瘤腺病毒联合其他方法治疗肾癌近年来，溶瘤腺病毒联合放疗为肿瘤治疗新方法提供了可能性。研究报道，溶瘤腺病毒可增强放射治疗的效果[21]。Chen等[22]采用携带Ki-67启动子并调控表达白细胞介素24（IL-24）的溶瘤腺病毒Ki-67-ZD55-IL-24，分别感染肾癌细胞株786-O、Ketr-3。结果显示，Ki-67-ZD55-IL-24联合放疗与Ki-67-ZD55-IL-24单独治疗相比，两者在E1A蛋白及IL-24表达水平上无明显差异，说明放疗不会影响溶瘤腺病毒的复制能力。而联合治疗的细胞杀伤效果优于Ki-67-ZD55-IL-24单独治疗或单独放疗。

溶瘤腺病毒联合化疗治疗肾癌的研究也显示了较好的治疗效果。在E1A、E1B双突变溶瘤腺病毒治疗肾癌的研究中，采用肾癌细胞株TOS-3LN构建了重症联合免疫缺陷小鼠肾癌模型，经肿瘤内注射AxdAdB-3及腹腔内注射吉西他滨（120mg/kg），比较治疗后肿瘤大小改变，发现单独使用AxdAdB-3或吉西他滨均可对肾癌细胞产生细胞杀伤效果，而AxdAdB-3联合吉西他滨杀灭肿瘤细胞的效果更显著，能抑制肿瘤细胞生长[8]。

4 溶瘤腺病毒治疗肾癌的临床研究

目前已有较多文献报道了溶瘤腺病毒治疗其他肿瘤的临床试验，而溶瘤腺病毒治疗肾癌的临床研究极少，仅在一项溶瘤腺病毒治疗多种类型肿瘤的Ⅰ期临床试验中涉及RCC。Garcia-Carbonero等[23]将17例计划手术治疗的肿瘤患者（可切除的结直肠癌、非小细胞肺癌、尿路上皮癌、肾癌）纳入研究，在第1、3、5天肿瘤内或静脉注射溶瘤腺病毒ColoAd1，并于第10～25天接受手术治疗。其中3例RCC患者术前均为静脉内注射溶瘤腺病毒，结果显示注射溶瘤腺病毒后均未出现3～4级并发症，且在手术标本中均可发现病毒DNA。虽然该研究样本量少，不足以证实临床应用溶瘤腺病毒的安全性，但可为溶瘤腺病毒治疗肿瘤的进一步研究提供参考，具有重要的临床意义。