HIF-1α和HIF-2α蛋白在宫颈癌中的表达及与预后的关系

刘艳梅 杨琪 王赛赛 应申鹏

宫颈癌是女性第三大恶性肿瘤，病死率在世界女性癌症中位居第四[1]。在我国，虽然随着卫生条件的不断改善，宫颈癌的发病率及死亡率呈明显下降趋势，但是据前几年统计，每年平均仍新增病例约13万例，占现有病例数的三分之一，每年因宫颈癌死亡的人数有6万之多[2]。所以，如何提高宫颈癌的治愈率，是目前需要解决的重要课题。目前，局部晚期宫颈癌患者的标准治疗模式为同步放化疗，该模式虽然能使患者5年生存率提高6%，但仍有接近三分之一的患者会出现局部复发或远处转移。

缺氧诱导因子（hypoxia inducible factor，HIF）是一种异二聚体转录因子，由结构同源的α亚基和共同的β亚基组成。研究发现，哺乳动物中HIF主要有3种亚基（HIF-1α、HIF-2α 和 HIF-3α），而目前对于 HIF-1α 和HIF-2α蛋白研究较多。Li等[3]研究报道，缺氧环境会激活HIF，而HIF通过激活靶基因来促进肿瘤的发生、发展及耐药。笔者团队前期研究结果也提示HIF-1α和HIF-2α蛋白在宫颈癌中呈高表达[4]。本研究将进一步探究了宫颈癌中HIF-1α和HIF-2α蛋白的表达特点及其与疾病预后的关系。

1 对象和方法

1.1 对象 将2010年1月至2015年12月本院放疗科收治的宫颈癌患者68例设为实验组，年龄37～90岁，平均（68.10±15.27）岁；以本院 2013年 1月至 2015年12月收治的30例宫颈良性病变患者作为对照组，年龄28～43岁，平均（35.2±4.31）岁。每例患者治疗前均经宫颈活检留取3块组织，以10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，用于免疫组化检测。所有患者取样前均经病理学检查明确诊断，且未经过放疗或化疗。

1.2 主要试剂 HIF-α多克隆抗体购于Abcam公司（批号：BA09541）；免疫组化相关试剂盒及二抗均购于北京中杉金桥公司；实验其他相关试剂均购于温州长丰生物科技有限公司。

1.3 免疫组化检测HIF-1α和HIF-2α蛋白表达 所有蜡块标本均行4μm切片，68℃烘烤2h，先后经过抗原修复、封闭，依次加入一抗50～100μl（HIF-1α蛋白抗体稀释比例1:100、HIF-2α蛋白抗体稀释比例1:250），二抗 40～50μl，37℃孵育 1h，显色、复染、脱水，封片后显微镜下观察，由本院2位有经验的病理科医师读片。HIF-1α和HIF-2α蛋白表达阳性为细胞质或细胞核中呈棕黄色颗粒，综合阳性细胞所占比例及着色强度得出最终评分。评判标准：（1）阳性细胞评分：＜1%为0分，1%～10%为1分，11%～50%为2分，51%～80%为3分，＞80%为4分；（2）着色强度计分：0分（未染色），1分（弱染色），2分（中染色），3分（强染色）。两个分值相加为最终评分：0～1 分（-）、2～3 分（+）、4～5 分（++）、6～7 分（+++），其中（++）和（+++）记为阳性。

1.4 患者随访 详细登记每例患者的免疫组化结果，并在治疗后完成规律随访，详细记录患者复查结果[5]。

1.5 统计学处理 应用SPSS 23.0统计软件。计量资料以表示；计数资料以百分数表示，组间比较采用χ2检验，HIF-1α和HIF-2α蛋白表达的相关性分析采用Spearman秩相关，生存分析采用Kaplan-Meier绘制生存曲线。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HIF-1α和HIF-2α蛋白在宫颈癌和正常宫颈组织中的表达 免疫组化检测结果见图1。实验组中HIF-1α及HIF-2α蛋白的阳性率均明显高于对照组（均P＜0.01），见表 1。

图1 HIF-1α和HIF-2α蛋白在宫颈癌和正常宫颈组织中的表达（a:HIF-1α蛋白在正常宫颈组织中的表达；b：HIF-1α蛋白在宫颈癌组织中的表达；c：HIF-2α蛋白在正常宫颈组织中的表达；d：HIF-2α蛋白在宫颈癌组织中的表达；免疫组化染色，×200）

表1 两组患者宫颈癌组织中HIF-1α和HIF-2α蛋白表达间比较[例（%）]

2.2 宫颈癌组织中HIF-1α和HIF-2α蛋白表达的相关性 68例宫颈癌组织HIF-1α和HIF-2α蛋白表达双阳性31例，双阴性的9例，HIF-1α蛋白阳性而HIF-2α蛋白阴性11例，HIF-1α蛋白阴性而HIF-2α蛋白阳性17例，两者表达无明显相关性（r=0.89，P＞0.05）。

2.3 HIF-1α和HIF-2α蛋白表达与宫颈癌患者临床病理特征的关系 HIF-1α和HIF-2α蛋白表达与宫颈癌患者的年龄、肿瘤大小、鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）抗原水平均无关（均 P ＞0.05）；但与淋巴结转移及放疗前贫血均有关（均P＜0.05），另外，HIF-2α蛋白表达与肿瘤分期亦有关（P＜0.05），见表2。

2.4 宫颈癌患者HIF-1α和HIF-2α蛋白表达与预后的关系 截止2018年6月，HIF-1α蛋白阴性者的中位无病生存期（DFS）和总生存期（OS）分别为 79.53和80.23个月，长于HIF-1α蛋白阳性者的50.7和49.23个月，其中OS具有统计学差异（P＜0.05）。HIF-2α蛋白阴性者的中位DFS和OS分别为70.57和72.77个月，长于HIF-2α蛋白阳性者的50.7和49.63个月，但均无统计学差异（均P＞0.05），见图2。进一步根据HIF-1α和HIF-2α蛋白表达不同组合进行分组比较，结果均无统计学差异（均 P＞0.05），见表3、图3。

表2 HIF-1α和HIF-2α蛋白表达与宫颈癌患者临床病理特征的关系

3 讨论

宫颈癌的发病率及死亡率仍然逐年攀升，严重威胁着女性的健康[6]。众所周知，宫颈癌的发生、发展是个复杂的过程，有报道认为氧化应激（reactive oxygen species，ROS）在肿瘤的形成与发展过程中发挥着重要作用[7]，肿瘤细胞均处于缺氧环境，为了维持自身繁殖，肿瘤细胞通过活化细胞信号通路以适应缺氧状态[8]。缺氧环境激活转录因子HIFs、生长因子受体活化磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）等信号通路，从而使肿瘤细胞适应缺氧环境，促进肿瘤发生发展及对治疗的耐药。笔者前期工作已初步证实，宫颈癌中HIF-1α与HIF-2α蛋白同时存在高表达，本研究在此基础上，通过扩大样本量，深入分析它们的表达情况与宫颈癌患者临床病理特征的关系，并进一步分析其对宫颈癌患者预后的影响。

图2 HIF-1α和HIF-2α蛋白阳性与阴性表达宫颈癌患者的生存曲线

表3 HIF-1α和HIF-2α蛋白表达不同组合宫颈癌患者预后的比较

图3 HIF-1α和HIF-2α蛋白表达不同组合宫颈癌患者的生存曲线

HIF是一组由同源的α亚基，以及共同的β亚基组成的异二聚体转录因子[9]，目前研究得较多的是HIF-1α和HIF-2α蛋白。HIFs可通过诱导肿瘤血管生成、细胞能量代谢等相关基因的表达而促进肿瘤的发生[10]。既往研究证实，大多数实体瘤中都存在HIFs高表达[11]。本研究结果显示，宫颈癌组织中同时存在着HIF-1α和HIF-2α蛋白的高表达，再一次证实HIFs在实体瘤的发生、发展中起着重要作用。HIF-1α和HIF-2α蛋白有着42%的相同氨基酸序列，但是两者的作用机制仍然存在差别，HIF-1α蛋白主要调控血管新生，而HIF-2α蛋白主要调控血管功能。本研究再次证实了HIF-1α和HIF-2α蛋白在宫颈癌组织中的表达无相关性，与马丽等[12]在胃癌中的研究结果一致，提示在肿瘤的发生、发展中，两者可能具有不同的作用。同时，本研究进一步发现，HIF-1α蛋白高表达与宫颈癌患者的淋巴结转移及放疗前贫血呈正相关，而与患者年龄、肿瘤大小、SCC抗原及FIGO分期等无相关关系；而HIF-2α蛋白的高表达除了与淋巴结转移及放疗前贫血呈正相关，还与FIGO分期相关，这个结果再次提示HIFs在肿瘤的发生、发展中可能起着不同的作用。

除此之外，本研究还探讨了HIFs的表达水平与宫颈癌患者预后的关系，发现HIF-1α蛋白表达阳性的患者中位DFS及OS均差于表达阴性的患者，同时OS具有统计学差异。Zhang等[13]通过对236例胃癌的研究发现，HIF-1α蛋白在胃癌中高表达，尤其在复发的胃癌患者中表达水平较高，推测其是预后不良的指标，可能促进肿瘤的进展，这与本研究的结果类似。Li等[14]在骨肉瘤中发现HIF-2α蛋白的高表达可能预示着预后不良，Yang等[15]对肝癌的研究却得到了相反的结论，认为HIF-2α蛋白的高表达与肝癌患者预后呈正相关。而本研究发现HIF-2α蛋白阳性患者的DFS及OS均明显短于阴性患者，但无统计学差异，这可能与本研究患者以局部晚期为主有关，下一步研究将扩大样本量，增加不同分期的患者再进行分析。此外，本研究进一步根据两者的表达状态将患者分为两者双阳性、HIF-1α蛋白阳性、HIF-2α蛋白阳性、两者双阴性4组，进一步比较发现单阳性及两者双阴性的患者DFS和OS均长于双阳性患者，但统计学处理提示无统计学差异，可能与分组样本量较少有关。但是此结论初步提示HIF-1α和HIF-2α蛋白的表达可能预示着宫颈癌患者的不良预后，为今后分子水平的研究提供了一个方向[16]。

综上所述，本研究进一步得出结论，在宫颈癌组织中存在HIF-1α和HIF-2α蛋白的高表达，两者的高表达可能预示着患者的预后不良，但它们在宫颈癌发生、发展中的作用以及具体机制有待进一步研究。