烟酒致癌物致口腔细胞恶性转化的研究进展

时小婷，潘亚萍

（中国医科大学附属口腔医院牙周科，沈阳 110002）

肿瘤的形成是复杂的长期过程，不仅包括细胞多阶段的多基因突变积累，也包括细胞与外部微环境的相互作用。肿瘤的发生发展至少包括起始、促进和进展3个阶段，影响因素众多，其中化学致癌物是种类最多、影响最广的环境致癌物［1］。按照致癌方式，致癌物可分为直接致癌物和间接致癌物，直接致癌物无需活化即可致癌，间接致癌物需要在体内代谢活化成终致癌物，因此也被称为“前致癌物”［2］。口腔作为消化系统和全身器官的起始部分，是人体与外界环境交换的场所，暴露的复杂性高。来自环境、饮食等外源性暴露及与口腔微生物群相互作用并产生化学物质等内源性过程均可能导致细胞DNA损伤，从而导致基因突变［3］。吸烟和饮酒是与口腔细胞恶性转化联系最密切的因素。烟草中的多环芳烃、N-亚硝胺以及酒精在口腔内代谢产生的乙醛等，均为化学致癌物。将化学致癌物用于构建致癌模型，是研究肿瘤发生发展机制、发现细胞恶性转化过程中的关键靶点以及研究抗肿瘤药物功效的常用有效手段。本文对这几种口腔内常见化学致癌物在肿瘤发生发展中的相关研究做一综述。

1 苯并芘［benzo（a）pyrene，B（a）P］

多环芳烃是多种含碳有机物在热解和不完全燃烧时产生的环境污染物，其本身和形成的二次污染物对人和动物都有极强的毒性。其中，B（a）P是第一个被发现的环境化学致癌剂，其来源广泛，致癌性强。国际癌症研究机构于2005年将B（a）P由人类可疑致癌物升级为人类确定致癌物。B（a）P不仅有致癌性，还具有很强的致畸性、致突变性和干扰内分泌的作用，可经皮肤、黏膜进入体内，损伤人体器官。

B（a）P本身无致癌活性，需要被细胞色素酶P450（cytochrome P450，CYP）代谢成终致癌物苯并芘-7，8-二醇-9，10-环氧化物［benzo（a）pyrene-7，8-dihydrodiol-9，10-epoxide，BPDE］发挥致癌作用。BPDE具有亲电子性，能结合在碱基上形成DNA加合物，其中BPDE-N2-dG DNA加合物能够稳定存在于肺、血液及肝等多种组织［4］。BPDE造成的线粒体DNA损伤是核DNA损伤的数倍，可能与线粒体内CYP的表达或线粒体缺乏核苷酸切除修复有关，也有研究［5］认为线粒体DNA突变是由氧化应激反应而非BPDE相关的线粒体DNA损伤引起。BPDE能够诱发原癌基因Ras过表达及抑癌基因p53突变，干扰基因产物的正常表达或导致基因产物的功能改变。

YE等［6］在以往建立永生化口腔上皮细胞系（human immortalized oral epithelial cell，HIOEC）的基础上，采用B（a）P体外诱导HIOEC恶性转化，经96代培养筛选，获得与临床病理相似的Ⅰ～Ⅱ级鳞状细胞癌细胞系HIOEC-B（a）P，经连续传代获得具有更明显肿瘤学特征的HB-2细胞系。研究结果表明，在人乳头瘤病毒、B（a）P和生长因子等因素作用下，HIOEC可以发生逐步恶变。DONG等［7］用B（a）P和二甲基苯蒽联合处理异常口腔白斑细胞DOK，获得癌变的细胞系OSCC-BD，并通过蛋白组学方法发现，OSCC-BD与DOK间的差异蛋白主要和细胞周期、细胞增殖、DNA复制、RNA拼接以及凋亡相关，为早期诊断提供生物标志物。WANG等［8］对中国农村部分烧煤地区的健康非吸烟女性的口腔颊黏膜上皮细胞进行基因组学分析，发现有烟煤比无烟煤引起更多的基因表达水平改变，包括分泌型炎性细胞因子白细胞介素-8的升高和凋亡分子caspase3的降低，这些基因的改变与B（a）P这类致癌多环芳烃相关。在对B（a）P致癌机制研究的过程中，很多关键的促癌或抑癌靶点逐渐被发现。KUNDU等［9］对长期咀嚼烟草的人群进行回顾性研究，发现这类人群存在口腔鳞状细胞癌的基因易感性，并发现DFNA5变体可能在抵御烟草相关口腔鳞状细胞癌的发生中对正常细胞起保护作用。最近研究还发现，不饱和脂肪酸及其代谢物可以对B（a）P的代谢产生不同影响。TYLICHOVÁ等［10］发现，在结肠癌细胞中多不饱和脂肪酸下调CYP1的酶活性，改变B（a）P代谢并降低其基因毒性。而ZAPLETAL等［11］发现，维持结肠体内平衡的丁酸盐在与B（a）P共同作用下，能显著诱导结肠癌细胞中CYP1表达。

2 N-亚硝基降烟碱（N’-nitrosonornicotine，NNN）

NNN是烟草特有的N-亚硝胺类物质之一。通常来说，NNN在烟草N-亚硝胺类物质中的含量较高，致癌性较强。烟草特有的N-亚硝胺类物质有3种特性：存在于全部的烟草制品；在烟草中特有而不存在于其他制品；都是强致癌剂。鉴于以上3种特性，NNN能够在探索烟草成分是否为吸烟人群罹患肿瘤的主要引发因素的相关研究中作为有效的生物标志物，如通过质谱法定量检测人类尿液、血液中NNN代谢物的含量，或者通过测定组织、血液和口腔细胞中的DNA和血红蛋白加合物，确定受试者对烟草的吸收量［12］。

NNN的致癌性源自体内的代谢活化过程。在啮齿类动物体内，NNN的主要代谢途径为吡咯烷环的2’-和5’-羟基化，生成麦斯明、4-羟基-1-（3-吡啶基）-1-丁酮、1-（3-吡啶基）-1，4-丁二醇、内半缩醛、内酯等，进一步生成尿液中NNN的主要代谢物——吡啶基丁酮酸和吡啶基羟基酸［13］。其他代谢途径还有吡啶环N-氧化生成NNN-N-氧化物、吡咯烷环的3’-和4’-羟基化，以及生成去甲基可替宁等。

NNN具有手性结构，以2’位置为手性中心有对映体（S）-NNN和相反对映体（R）-NNN，其中（S）-NNN是烟草制品中NNN的主要形式。不同结构的NNN在恶性转化中有不同的效应。多项研究［14-15］表明，采用饮水法给大鼠、仓鼠或其他实验动物饲以NNN，能诱导不同部位的肿瘤，其中食管、口腔、肝脏可见不同程度的NNN代谢物及DNA加合物产生，NNN被确认为强口腔致癌物质。有趣的是，研究发现（S）-NNN形成的DNA加合物明显超过（R）-NNN，强烈提示（S）-NNN对大鼠食道、口腔、肝脏的致癌性高于（R）-NNN，（R）-NNN的致癌活性较弱，但协同增强（S）-NNN的致癌性［15］。（S）-NNN能显著影响免疫调节、炎症和肿瘤相关基因，经（S）-NNN处理的永生化口腔角质形成细胞、未处理的癌前口腔细胞及恶性口腔和头颈部鳞状细胞中均出现相关基因的异常表达，与体内实验结果一致。研究［16］表明，烟草烟雾中的致癌剂能在肿瘤始发及扩大克隆过程中诱导癌前肺上皮细胞发生干细胞信号通路和上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）基因的改变。与此一致，（S）-NNN处理的大鼠食管组织以及（S）-NNN和（R）-NNN处理的永生化口腔角质形成细胞中，Wnt6等可调节正常细胞和癌症干细胞的增殖过表达及调控上皮细胞向间充质转化的基因过表达［17］。

3 酒精源性乙醛

酒精被国际癌症研究机构归类于确定的人类致癌物。饮酒会增加患肝癌、乳腺癌、直肠癌和上消化道癌的风险［18-19］。酒精的毒性及致癌作用主要表现在其代谢产生的乙醛的反应活性造成DNA损伤。尽管酒精中的乙醇主要在肝脏中代谢，但一些针对人类的研究［20］发现，在饮酒后即刻检出唾液中的乙醛含量高于血液中的乙醛含量。当人类口腔细胞和灵长类动物口腔组织暴露于酒精环境下时，乙醛衍生的DNA损伤的检出率及检出水平均增加，说明口腔内乙醇来源的乙醛暴露可能独立于肝脏代谢，因而可能是一个独立的肿瘤危险因素。口腔内酒精源性乙醛暴露受多种因素影响，如口腔黏膜细胞和唾液腺的代谢，相关代谢酶的缺陷，口腔微生物代谢，以及营养、心理和环境等因素［21-22］。

口腔内对乙醇代谢起非常重要作用的不是口腔黏膜细胞和唾液腺，而是口腔微生物。人类口腔黏膜乙醇脱氢酶活性非常低。现有研究［23］已证实，多种酵母菌和细菌能够在体外将乙醇氧化成乙醛。TAO等［24］在研究链球菌对酒精的代谢及链球菌与人乳头瘤病毒在口腔角化细胞恶性转化中的交互作用时发现，链球菌显著增强细菌对角化细胞的黏附，进而能促进人乳头瘤病毒感染，并提高乙醛加合物形成、异常增殖、迁移等多种恶性表型的发生率。GAO等［25］发现牙龈卟啉单胞菌能够将乙醇转化为乙醛，且产生的乙醛的量足以引起DNA损伤、基因突变以及上皮细胞增生。以上研究提示，不良口腔卫生可能导致菌群失调，成为酒精相关口腔癌的危险因素。

研究［26］显示，比较公认的人类致癌物10个关键特征，乙醛符合其中4点：亲电性、基因毒性、改变DNA修复和诱发氧化应激。乙醛可以与细胞成分中包括DNA、RNA和蛋白质在内的亲核中心反应，乙醛羰基能与DNA核苷反应生成DNA加合物。乙醛作用于细胞，使DNA单链断裂、点突变、DNA互相交联、微核和染色体畸变等基因异常的现象不断累积，很大程度上促进细胞恶性转化。最新研究［27］显示，乙醛可以在相邻碱基间诱导一种GG链内交联的DNA损伤。体内实验［28］表明，乙醛具有致癌性。虽然针对人类的相关病例报道和流行病学研究有限，但大自然提供了一种独特、可量化的人类乙醛暴露模型，任何其他明确致癌物都无法用于这种模型——乙醛脱氢酶2缺陷型者。此类人群在饮酒时，唾液使局部乙醛浓度显著升高，只要酒精停留在血液循环中，通过唾液增强的乙醛含量就会持续增加［29-30］。以上研究表明，酒精源性乙醛可以作为研究酒精相关肿瘤疾病的处理因素。

SAAD等［31］对136例头颈鳞状细胞癌患者样本进行RNA测序并进行体外定量PCR验证，发现经乙醇处理后，上调最显著的分子是miR-30a和miR-934，能够引起细胞增殖增强和抗凋亡基因Bcl-2的表达上调。YU等［32］对34例饮酒及非饮酒的头颈鳞状细胞癌患者样本进行RNA测序并进行体外实时定量PCR验证，发现经酒精和乙醛处理后的口腔角化细胞中长链非编码RNAlnc-PSD4-1和lnc-NETO-1表达上调，在Cox比例风险回归模型中，lnc-PSD4-1低表达与高生存率有很强关联。以上临床数据及体外模拟实验说明，酒精及酒精源性乙醛能促进细胞异常增殖，产生DNA损伤，并引起多个分子的异常表达，找到乙醛对细胞恶性转化作用中的关键靶分子，将有助于控制酒精相关肿瘤的进程。

4 总结

综上所述，烟草和酒精中含有与口腔肿瘤密切相关的化学致癌物。B（a）P存在于烟草中，是作用于口腔细胞的烟草烟雾及煤烟有害成分的代表物质；NNN是烟草特异亚硝胺，可作为生物标志物，在实验及临床中通过检测口腔细胞内其代谢物含量确定烟草摄入含量；酒精源性乙醛在促细胞恶性转化过程中与口腔微生物关系密切。以上化合物均是环境致癌物，能作为相关肿瘤的处理因素，更准确地体现人类口腔癌发生发展过程中涉及的细胞和分子的变化，有助于提出更有针对性的防治策略。