梅毒螺旋体慢性持续性感染相关机制研究进展

汤兰桂 江晗 张晓红 赵飞骏

梅毒是由梅毒螺旋体（Treponema pallidum，Tp）所致的一种临床表现复杂、可阶段式发展、晚期可导致多脏器病理损害的人类性传播疾病，严重威胁公众健康。Tp 因其公认的早期传播及强大的免疫逃逸能力被称为“隐形病原体”。到目前为止实验室仍然无法对其进行人工培养和遗传操作，Tp 致病机制的研究尚存在许多障碍。获益于Tp 全基因组序列的破解以及蛋白重组技术的普及，近年来，在Tp 蛋白质组、细胞结构以及生理、代谢和调节等方面已经取得了较大进展。本研究整合了有关Tp致病机制的相关研究，期望从多方面描述Tp 造成慢性持续性感染的相关机制，现综述如下。

1 Tp 特殊的生理代谢途径

Tp 的发现可以追溯到1906年，但是至今没有找到有效的体外连续传代培养的方法，目前仍然主要依靠建立兔感染模型来进行相关研究。Tp 只有在宿主体内营养丰富、高度稳定的内环境中才能获得所有必需的营养素得以正常增殖、传代。高度适应的寄生生活使得Tp 缺乏核苷酸、脂肪酸、维生素、辅因子、氨基酸、三羧酸循环以及氧化磷酸化等从头合成的相关基因[1]，进化出螺旋体中最小的基因组，同时也是基因组最小的致病菌之一。通过生物信息学的分析技术可以预测Tp 基因组大约编码400 多种蛋白质。较小的基因组序列大大减少了抗原性物质的表达，从而减少Tp 被免疫系统清除的机会。有报道[2]通过动物实验研究显示，潜伏期的Tp 可在家兔的毛囊以及神经组织中寄生，从而躲避免疫系统的清除，形成慢性持续性的感染。

2 固有免疫应答系统

LPS（Lipopolysaccharide，LPS）是革兰氏阴性菌细胞膜高度促炎性糖脂，Tp 外膜缺乏脂多糖。研究表明[3]在Tp 感染的过程中，Tp 的多种膜脂蛋白能通过Toll 样受体2（TLR2）依赖的信号传导途径激活病灶内的固有免疫细胞，主要是巨噬细胞和树突状细胞（DC）。然而进一步的研究发现这些蛋白主要定位于Tp 细胞膜的内膜上[4]，导致通过表面暴露的病原体相关分子模式（PAMPs）对体内Tp 的清除效果有限。这种特殊的结构使得Tp 能够有机会躲避固有免疫应答系统的识别清除而反复传播。同时这也在一定程度上解释了为何Tp 感染缺乏感染性疾病特有的全身性炎症症状[5]。

3 适应性（特异性）免疫应答系统

按照特异性免疫应答的发展规律，机体调理抗体的出现，吞噬细胞可通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）吞噬Tp，并且通过相关信号传导促进溶酶体内螺旋体的内化、杀灭和降解。早期的实验通过既往感染梅毒的家兔血清进行被动免疫后再接种Tp，已经证明特异性抗体在潜伏期间抑制Tp 负荷起关键作用。然而Ceuz 等[6]的研究发现，在继发性和早期潜伏梅毒期间，尽管有高滴度的抗密螺旋体抗体存在，Tp 仍然能够在宿主体内存活。Tp 是如何躲避宿主特异性免疫系统的杀伤清除，形成慢性持续性的感染，目前报道主要有以下几种机制。

3.1 外膜蛋白表达稀少上世纪80年代通过冷冻电镜发现Tp的外膜蛋白含量（outer membrane proteins，OMPs）相比大肠埃希菌少约100 倍，稀少的外膜蛋白降低了其被机体免疫系统发现并清除的几率，但同时也限制了Tp 新陈代谢的效率，从而抑制了Tp 在宿主体内增殖的速率。外膜蛋白Tp0326（最初被称为Tp92）归属于β-桶体组装机械蛋白A（β-barrel assembly machinery protein A，BamA）蛋白家族，在Tp 基因组中，有且只有Tp92 基因与革兰氏阴性菌的外膜蛋白基因序列具有高度同源性[7]。Tp92 蛋白定位于细胞膜表面，序列恒定，预测应该可以刺激机体产生保护性的抗体。有报道[8，9]以纳米壳聚糖颗粒为载体，IL-2 为佐剂，将pcDNA3.1（+）/Tp92 疫苗接种于新西兰兔，发现Tp92 疫苗能刺激试验动物产生较强的免疫应答，但是保护作用有限，这与其在Tp 中的表达含量较低有关。Tpr 蛋白家族的组成有12 个（TprA-L）重复的蛋白。根据氨基酸排布的差异分为Tpr Ⅰ、Tpr Ⅱ、Tpr Ⅲ3个亚家族。Tpr 蛋白与齿垢密螺旋体（Treponema denticola）的主要外鞘蛋白（MOSP）具有序列同源性，是已知的成孔蛋白和粘附素[10]。通过计算机矩阵技术对Tpr 蛋白家族进行筛选，TprC（TP0117）、TprD（TP0131）、TprI（TP0620）均具有细菌外膜蛋白的显著特征—β-桶状结构[11，12]，这些蛋白在Tp 上的表达丰度也非常低，每个细胞只有约200 个拷贝。对于BamA，TprC/D 和TprI，大多数抗体针对周质结构域[12，13]，因此无法有效清除Tp。对于那些可能具有调理作用的抗体，目标蛋白质的极低拷贝数限制了它们的清除效能。体外实验[11，13]表明，大百分比的Tp 不能被针对TprC/D 或BamA的高滴度重组抗血清进行表面标记或调理。类似的，有研究表明Tp0750-Tp0751 蛋白酶复合物和TP0435 在一些密螺旋体的表面上低水平表达[14，15]，因此对抗体结合的可用性有限。

3.2 表面暴露相关结构域的缺乏Tp0453 被Hazlett等[16]证实为整合外膜蛋白，其二级结构主要含28%的α-螺旋和18%的β-折叠，这个比率与经典的整合外膜蛋白相比有较大差异。通过免疫荧光技术进一步发现Tp0453 蛋白缺乏表面暴露相关结构域，从而推测这种外膜蛋白的特殊结构组成有利于其逃避宿主免疫反应，潜伏在宿主体内发展成为持续的慢性感染。

3.3 外膜蛋白的异质性人们一致认为对抗体结合的抗性是Tp 免疫逃逸的基础，但早期免疫标记实验表明，Tp 的外膜是抗原性惰性的[17]。后来的生物学分析证实了Tp 感染刺激产生了与Tp 外膜蛋白结合的抗体。有研究表明[18]，在梅毒患者体内Tp 可以分为两个亚群，一个亚群可以与抗体结合，而另一个亚群不与相应的抗体发生反应，并且Tp 菌体结合抗体后仍然具有一定的动力学特征。Giacani等[19]发现在不同Tp 菌株之间，存在基因表达上的差异，并且可以通过这种差异对Tp 菌株进行分型。通过对不同来源的Tp 菌株分析发现，Tp 外膜蛋白亚族成员基因变异现象不同程度的存在，这些观察结果证实体内Tp 的清除和存留同时发生[18]。在特定的病灶，与抗体结合的Tp 被缓慢的清除，同时也刺激着局部炎症的发展，而免疫逃避的未结合亚群将在局部复制并全身传播。目前发现Tp 的抗原异质性主要通过以下两种方式产生：

3.3.1 外膜蛋白基因的多态性 目前已经证实Tpr基因家族的各成员存在不同程度的易变性，TprⅠ、Tpr Ⅱ、Tpr Ⅲ各亚族基因均具有按不同规律分布的保守区及可变区，从而导致其氨基酸序列呈现高度的变异性。其中TprK（Tp0897）抗原是最早受到关注的变异性抗原，其属于Tpr Ⅲ亚族。Tp0897蛋白位于外膜表面[20]，中间区域氨基酸组成保守，两侧有7 个区域氨基酸序列变化较大，为可变区（V区），其还具有一个包含3～7 个异质区的中央亲水区（CHR），各异质区序列组成差别较大，且具有一定的种属特异性。TprK 基因序列不仅在各菌株之间具有高度变异而且在菌株内部，其碱基序列也存在高度变异[21]。TprK 基因的7 个可变区中包含众多的复等位基因，其中基因转换在V6 区发生率最高[21]。众多的复等位基因构成了TprK 蛋白抗原多样性的结构基础。在Tp 感染期间，V 区表位被B细胞识别，由于TprK 序列的抗原变异，针对TprK V 区的特异性抗体效用差异巨大，并且抗体滴度也随着宿主的间的个体差异而存在较大差别[21]。动物实验也证实了这一观点，逃避免疫清除导致播散性梅毒疹的Tp 绝大部分（96%）是来源于同一个TprK 变体；通过比较免疫功能正常与免疫功能抑制兔模型中TprK 抗原变异程度，证实了机体免疫抑制也会相应减少Tp 感染期间TprK 序列的变异频率；TprK 蛋白免疫宿主后，宿主针对Tp 菌体的TprK 抗原各表位产生了特异性免疫反应，并诱导Tp 产生了新的TprK 变异。这表明在宿主免疫压力下，TprK 抗原可相应持续变异，原有的或新产生的TprK 抗体均不能识别不断变化的TprK 抗原从而发挥有效的免疫清除作用，使得Tp 能够逃避机体的特异性免疫应答。对菌株SS14 基因组的重新测序揭示了TprD（Tp0131）在菌株内的序列异质性[22]，其作为外膜蛋白的β-桶组成部分，表明该Tp 外膜蛋白（OMP）也发生着抗原变异。此外，Tp0136基因的开放阅读框（ORF）在Tp 的各个亚种或菌株之间也被发现存在高度的多态性[23]。

3.3.2 外膜蛋白基因的错配 Giacani 等[24]研究发现，Tp 外膜蛋白Tpr Ⅱ亚群基因在复制过程中，紧挨着转录起始位点上游的G 核苷酸重复数目的变化会导致滑链错配的发生，从而导致TprE、TprG 和TprJ 在不同的菌株中存在一定的异质性。

4 极强粘附及穿透能力

Tp 可以与哺乳动物多种细胞类型以及细胞外基质蛋白结合，特别是层粘连蛋白和纤维连接蛋白。通过生物信息学鉴定技术并联合结合试验，目前已经鉴定的粘附素有纤连蛋白黏附素Tp0155、Tp0435（Tpp17）和Tp0483，和核纤层蛋白黏附素Tp0751[25]。Tp0751 还是一种锌依赖性金属蛋白酶，Tp0751 与Zn2+形成的复合酶，能够将血凝块以及细胞外的基质成分进行降解，从而有利于Tp 在机体内感染的扩散。Tp0136 是一种脂蛋白，其能与纤连蛋白结合起到粘附素的作用。目前也已证实，其在不同的菌株之间存在序列上的异质性[23]。这些结构赋予了Tp 极强的粘附及穿透能力。当Tp通过皮肤、粘膜或者性活动产生的皮肤破裂进入机体，附着于宿主细胞和细胞外基质的开始其感染的关键步骤，在上皮下方定植以后，Tp 局部繁殖并通过淋巴管和血流传播至全身。Tp 的弯曲，平波形态使其能够穿透整个身体的组织和血管屏障，配合其周质运动装置通过前后波动[26]可使其顺利侵入深部内脏、肌肉骨骼以及脑部神经组织甚至远端的皮肤、粘膜、毛囊等部位，从而躲避免疫宿主免疫系统的清除获得后续传播的机会。

经过漫长的进化，Tp 高度适应人体内的寄生生活，其感染机制十分复杂，涉及新陈代谢、结构、基因的表达及调控等各方面。深入了解Tp 慢性持续性感染相关机制对于梅毒的治疗、诊断抗原的筛选，尤其是梅毒疫苗的研发有着深刻的指导意义。随着研究的深入，特别是基因工程、生物信息技术的广泛使用，目前对Tp 的结构及蛋白组成都有了比较全面的了解，在这个过程中对其部分感染机制有了在分子水平上的合理解释。但是要全面揭示Tp 在人体内如何躲避免疫系统的清除而长期持续存活，仍然需要长期的探索。