鹅膏毒肽类毒素检测方法的研究进展

张晓萌，秦鸣蔚，赵新月，宋玉竹，张金阳，夏雪山，韩芹芹

(昆明理工大学 生命科学与技术学院，云南 昆明，650500)

根据鹅膏肽类毒素氨基酸的组成和结构,鹅膏肽类毒素可分为鹅膏毒肽、鬼笔毒肽和毒伞素3类，其中鹅膏毒肽是一类双环八肽。鹅膏毒肽化学性质稳定，耐高温、耐干燥和酸碱，一般的烹调加工不会破坏其毒性，该类毒素易溶于甲醇、乙醇和水，分子质量在973～990 Da[1]。根据侧链取代基团不同鹅膏毒肽又可以分为α-amanitin、β-amanitin、γ-amanitin、∑-amanitin等，其半致死量分别为0.3、0.5、0.2和0.3 mg/kg。据报道，每年世界各地都有成千上万的蘑菇中毒事件发生[2-6]，蘑菇中毒引起的死亡90%是由含鹅膏毒肽毒素的蘑菇导致[7]。当人们误食含有鹅膏毒肽的毒蘑菇时，会产生剧烈恶心、呕吐、腹痛或腹泻等情况，严重则会引起多器官衰竭进而导致死亡[8-11]。研究表明，虽然现有多种针对鹅膏毒肽的检测技术，但是这些检测技术都存在一些弊端，如成本高、耗时长、需要专业的检测仪器和检测人员等。不同的检测技术对蘑菇样品前处理方式需求也不同，更重要的鹅膏毒肽在血浆和尿液中代谢较快，浓度较低，故很多能够快速检测蘑菇样品中鹅膏毒肽的技术都无法运用到临床患者尿液和血液的快速检测[12]。所以，建立快速检测蘑菇、尿液和血浆中鹅膏毒肽的方法就显得尤为重要。本文分别就现有的快速检测蘑菇样本中鹅膏毒肽和快速检测血浆和尿液中鹅膏毒肽的技术进行阐述和分析。

1 蘑菇样本中鹅膏毒肽的快速检测

1.1 超分支滚环扩增(hyper-branched rolling circle amplification, HRCA)技术

与聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)严格的程序升温不同，HRCA技术是一种可以在恒温条件下指数扩增核酸信号的放大技术[13-14]，具有较高的扩增效率和灵敏度[15]。现已开发出许多基于HRCA技术的传感器，用于超灵敏性检测核酸。HE等[16]设计出一种针对鹅膏菌中α-amanitin基因序列的锁式探针，并基于HRCA技术建立检测方法。实验中加入SYBR Green I为指示剂，双链DNA与指示剂结合后增强荧光强度，可直接读取实验结果，无需琼脂糖凝胶电泳。此方法的检测限为100 copies/μL，是普通PCR方法的100倍，检测结果可在3 h内获得，同时也可用于蘑菇混合物中鹅膏毒肽的检测。该传感器提供了一种灵敏、快速的鹅膏毒肽检测方法，避免了农村地区无法使用昂贵仪器的限制。

1.2 酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)

ELISA是实验室目前最为常用的检测方法，这种方法主要是以抗原和抗体的特异性免疫结合反应为基础，在特定标记物如同位素、酶、荧光基团等的配合下将免疫反应扩大，用于对特定靶标的检测。酶联免疫反应相比其他检测方法具有特异性高、操作简单、不需要特定仪器等优点。

HE等[17]研究并制备出一种单克隆抗体，并利用其建立了一种利用间接竞争性免疫反应检测蘑菇样品中鹅膏毒肽的方法。在整个免疫反应中以α-amanitin与牛血清蛋白的偶联物(α-amanitin-OVA) 作为包被抗原，以鹅膏毒素作为竞争抗原，初步建立了检测蘑菇中鹅膏毒肽的间接ELISA。对蘑菇样品中鹅膏毒肽进行检测分析发现，此方法对蘑菇样品中α-amanitin、β-amanitin、γ-amanitin的检测限分别为4.55、4.9和4.45 ng/mL。在此基础上，采用高效液相色谱法对该蘑菇样品进行检测，检测结果表明2种方法之间具有较好的一致性。

BEVER等[18]开发了一种能同时检测α-amanitin、β-amanitin和γ-amanitin的检测技术，且检测的同时不会与结构类似物发生交叉反应。低分子量的鹅膏毒肽本身不具有免疫原性，不能发生免疫反应，但前期研究发现,当鹅膏毒肽与大分子物质如载体蛋白结合后，其结合物具备免疫原性。可利用4种不同的化学连接物质构建带有不同免疫原性的鹅膏毒肽与载体蛋白的偶联物，以达到产生与鹅膏毒肽结合的抗体目的，最终实验结果表明,只有2种方式成功产生了结合游离鹅膏毒肽的抗体，其中一种是利用高碘酸盐氧化这一新的连接方式，利用抗体建立竞争性酶联免疫反应，检测限为1.0 μg/mL。由于利用单克隆抗体的ELISA更适用于检测试剂盒，BEVER等[19]又制备出新的单克隆抗体(mAbs, AMA9G3和AMA9C12)。与多克隆抗体不同，单克隆抗体具有持久性和一致性[20]，从而克服了用于鹅膏毒肽检测的商用多克隆抗体(pAb)供应有限、不同批次有差别的难题，利用这一新的单克隆抗体建立的快速检测鹅膏毒肽的ELISA，检测限可以达到1 ng/mL。同时在检测蘑菇样品时,前处理方法简单，以鹅膏菌为样本，采用水等简单溶剂快速(1 min)提取鹅膏毒肽，大大缩短和简化了检测的时间和流程。

综上所述，ELISA具有操作简单、灵敏度高、特异性强等优点，适用于蘑菇样品中鹅膏毒肽的检测，根据ELISA原理开发的试剂盒将会大大缩短检测时间，改善基层难以检测的问题[21]。但是ELISA是一种利用抗原与抗体特异性结合的酶联免疫反应，在检测前期需要购买或制备能与抗原特异性结合的抗体，故该方法存在费用高、制备抗体耗时长等缺点。更重要的是虽然有许多ELISA试剂盒在市场上得到应用，但是大多数在评估基质效应、有效样品预处理的高交叉反应性等方面受到限制，因此限制了其实际应用，也不适用于检测血浆和尿液中的鹅膏毒肽。

1.3 侧流免疫层析法(lateral flow immunoassay, LFIA)

相比ELISA， LFIA具有使用简单、成本低廉和检测快速等优点。LFIA是一种快速诊断方法，且适用于现场检测，现已用于生物及食物安全检测中[22]。虽然ELISA是实验室常用的检测技术，但是需要借助专业的试剂和设备，耗时也较长。如果将ELISA中使用的免疫试剂转移到LFIA中将会解决以上问题。LFIA又被称为横向流动免疫检测技术[23]，是以条状纤维层析材料为固相，利用纤维层析材料上毛细管的吸附作用使滴在材料上的样品向前移动，最终通过显色反应达到检测样品中是否存在待检物的技术。在LFIA中，免疫反应的发生可以基于抗原、抗体的特异性结合或核酸适配体和靶标的特异性结合。近年来，一些与核酸适配体有关的肿瘤治疗技术已经在临床上得到应用[24]，核酸适配体的出现也使诊断研究发生了一定转变，相较于抗体，核酸适配体对于侧流免疫检测平台具有更好的无免疫原性及可标记适用性[25]。传统的LFIA主要分为双抗夹心层析法和竞争免疫层析法。根据LFIA原理开发的免疫试纸条主要是由样品垫、结合垫、吸水垫和硝酸维生素膜等构成，适用于大批量样本的定性实验[26]。

针对常规检测鹅膏毒肽的方法设备昂贵或步骤繁琐等弊端，BEVER等在上述酶联免疫吸附法基础上开发了一种竞争免疫层析法，他们将制备的单克隆抗体mAbs运用到LFIA上，通过实验确定LFIA检测的特异性和灵敏性。检测可在10 min内完成，检测结果可直接读取，其方法对α-amanitin和γ-amanitin的检测限都可以达到10 ng/mL。利用该LFIA对野生蘑菇进行检测，其检测结果与液相色谱结果一致性较好[27]。该方法实现了快速、便捷、灵敏检测蘑菇样本中鹅膏毒肽的目的，在一定程度上解决了ELISA抗体制备耗时长、需要仪器测定和不适用于现场检测等缺点，可用于大批量样品中鹅膏毒肽的快速检测[28]。

2 血浆和尿液中鹅膏毒肽的快速检测

由于鹅膏毒肽在血浆和尿液中代谢较快、浓度较低，因此常规检测蘑菇样本中鹅膏毒肽的方法(如ELFIA、紫外-可见光吸收光谱技术等)都无法运用到检测血浆和尿液上。含有鹅膏肽类毒素蘑菇中毒病例具有较长的潜伏期(6～24 h)，大多数病例的潜伏期为十几个小时[29]。因此一种能够适用于临床的快速检测鹅膏毒肽的检测方法就显得尤为重要。

2.1 高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)

GARCIA等[30]建立一种联用二极管阵列和电化学检测的HPLC技术。单一的HPLC技术限制了检测鹅膏毒肽时的灵敏度，二极管阵列和电化学检测法的联用将会大大提高检测范围和准确度。分别利用联用二极管阵列检测的HPLC和联用电化学检测法的HPLC技术对大鼠生物样品(肝脏、肾脏)进行鹅膏毒肽检测，色谱检测运行时间在22 min内，检测结果发现,联用电化学检测法时检测限更低，可达0.040 μg/mL。此外，研究还验证了此方法可用于人体血浆中鹅膏毒肽的检测。

2.2 液相色谱与质谱联用法(liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS)

MAURER等[31]将LC-MS运用到人类尿液样本中鹅膏毒肽的检测，因LC-MS检测方法具有灵敏度高、稳定性好等特点，LC-MS技术已在血浆和尿液样本检测中得到普遍使用。众所周知，如果将色谱与质谱联用，被测样品首先被色谱技术分离纯化，纯化后的样品进入质谱系统，故二者联用后会将色谱和质谱的优势进行互补，同时也会大大节省检测时间。研究发现，不同的LC方法和MS方法组合会对检测方法灵敏度的提高产生影响，现有更多的鹅膏毒肽检测手段是在LC-MS检测技术基础上发展而来的[32]。

2.2.1 超高效液相色谱-串联质谱技术(ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, UPLC-MS/MS)

UPLC-MS/MS可同时测定尿液或血浆中的6种毒肽(α-amanitin、β-amanitin、γ-amanitin、phallisacin、phalloidin和phallacidin)[33]。该检测方法的线性范围为0.2～20 ng/mL，这6种毒肽的检出限均低于0.06 ng/mL，在血浆和尿液基质中的加标回收率在79.6%～104.8%。

2.2.2 液相色谱-串联质谱技术(liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)

LC/MS技术虽然能够高灵敏度、快速并定量地检测鹅膏毒肽,但是存在一个明显弊端,在定量分析时受待测样品基质中所含的盐或其他共洗脱化合物影响较大，故该技术对样品的制备要求较高。样品制备优化和调试色谱条件可减小基质影响，但是最有效的手段是将一个同位素标记的内标物质引入到实验中，然而内标物质的选择也是检测结果能否准确的关键。ABBOTT等[34]首次将同位素标记的15N10-α-amanitin，作为定量检测尿液中鹅膏毒肽的内标物质，实现了同时对尿液中α-amanitin、β-amanitin、γ-amanitin的定量检测，三者检测限分别为0.458/0.930和0.169 ng/mL。

2.2.3 高效液相色谱/三重四级杆质谱联用法(high performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry, HPLC-MS/MS)

魏佳会等[12]建立了一种利用HPLC-MS/MS同时测定血浆和尿液中3类重要鹅膏毒肽类(α-amanitin、β-amanitin、phalloidin)、丙氨酸羟毒伞肽及二羟毒散肽等毒素的方法。此方法不仅可用于检测蘑菇样品中的鹅膏毒肽，也可用于检测患者血液和尿液中的鹅膏毒肽，检测时间为10 min左右。该方法对α-amanitin和β-amanitin在血浆和尿液中的检测限均为0.5 μg/mL，线性范围均为5～500 μg/mL，对二羟鬼笔环肽、丙氨酸羟毒伞肽及二羟毒散肽在血浆和尿液中的检测限为0.2 μg/mL。该方法具有样品需要量少、检测速度快、灵敏度高、回收率高等特点，可大大改善血液和尿液中毒素基质效应大、检测限高的问题。

虽然色谱与质谱联用法检测血浆和尿液样本中鹅膏毒肽表现出诸多优势，但是依然需要借助于昂贵的设备和专业的技术人员，检测成本较高，无法在现场检测中应用。

2.3 分子印迹技术(molecular imprinting technique, MIT)

大多数免疫反应是基于抗原与抗体特异性结合产生的，与抗原-抗体特异性结合有着相似的性质[35]，MIT是制备能与目标分子在特定结合位点结合的聚合物，该聚合物被称为分子印迹聚合物(molecular imprinted polymer, MIP)，它有着特定的空间结构和特异性识别能力。MIT具有高特异性、高稳定性和高预定性，现已广泛用于化学仿生传感器[36]，实现了定量分析各种小分子有机化合物的目的，在食品安全检测中有着重要应用[37]。现介绍2种基于MIT建立的检测血浆和尿液中鹅膏毒肽的化学传感器。

2.3.1 分子印迹荧光传感器

FENG等[38]将MIP的特异选择性和碳量子点(carbon quantum dots, CDs)识别放大光学信号的优势结合，设计MIP-CDs荧光传感器。在380 nm激发波长条件下进行荧光测量，通过MIP-CDs发射强度的变化检测血清中的鹅膏毒肽，其中MIP-CDs新型传感器的最佳响应时间为20 min，α-amanitin的检测限为15 ng/mL，在0.05～4.0 μg/mL范围内，荧光强度和α-amanitin浓度呈现良好的线性关系，样本回收率为97.8%～100.9%。实验结果表明该传感器具有较高的灵敏度和选择性，更重要的是样本无需经过任何预处理，即可达到快速检测血清中鹅膏毒肽的目的。

2.3.2 分子印迹光子晶体(molecularly imprinted photonic crystal, MIPC)传感器

QIU等[39]利用具有可见颜色的光子晶体完成传感器中信号转换工作，制备MIPC传感器。该传感器可用于实际样本(蘑菇、尿液和血清)中鹅膏毒肽的检测，检测限为5.0×10-10mg/L，线性范围为10-9～10-3mg/L，仅需要2 min的响应时间，实际样本的检测结果会出现明显的衍射峰红移和颜色变化。

基于MIT建立的传感器在一定程度上改善了LC-MS中样品前处理程序繁杂的问题，简化了实际样本的检测步骤。

2.4 免疫层析试纸条

BEVER等[40]根据LFIA开发的免疫试纸条，检测人类和狗的尿液中的鹅膏毒肽，α-amanitin和γ-amanitin检测限可达10 ng/mL，β-amanitin的检测限可达100 ng/mL，检测结果可直接由肉眼读取，检测时间为10 min。这证明了LFIA不仅可用于蘑菇样本中鹅膏毒肽的检测，也可用于尿液中鹅膏毒肽的快速检测。

3 结语

鹅膏毒肽作为一种具有剧毒性质的物质，为监管其在食品领域的安全，越来越多鹅膏毒肽的检测方法被研究报道。由于蘑菇样本、血浆和尿液等的特殊性，许多检测方法无法应用，鹅膏毒肽的快速检测方法还面临着一定的困难。HRCA和MIT为我们建立新方法开拓了思路，在一定程度上解决了某些地区无法使用昂贵仪器的问题。但是，这2种技术仍需要专业的技术人员和技术操作，很难实现检测技术的广泛使用。近年来，ELISA检测蘑菇样本中的鹅膏毒肽越来越普遍，此方法具有操作简单的特点，同时为之后商业化鹅膏毒肽检测试剂盒的生产提供了技术支持，但ELISA的稳定性还需要进一步提高。虽然现在用于人体血浆和尿液样本中鹅膏毒肽的快速检测方法还多为色谱与质谱联用法，受到昂贵实验仪器、设备和专业技术水平的限制。但是随着简便、快速、适用于大量样本的LFIA不断发展，会为临床建立更加便捷的、适用于现场的鹅膏毒肽检测方法提供重要的技术手段。