以耳鸣遗传关联研究为案例的研究生培养方案探讨

牛玉光 李元丰 田英丽 于慧颖

1中国人民解放军总医院第一医学中心日间诊疗科（北京 100853）

2军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所，蛋白质组学国家重点实验室，国家蛋白质科学中心（北京 100850）

3中国人民解放军联勤保障部队第九六四医院（安徽 130117）

4中国人民解放军第五医学中心门诊部(北京 100071)

耳鸣是指患者在客观上未受外界声源或电刺激，却在主观上存在声音感知的一种临床症状，可伴有焦虑、抑郁等心理疾病。耳鸣在普通人群中的发生率约为3-30%，其中约有1-3%的患者因耳鸣而影响正常的生活和工作。因此，耳鸣与耳聋、眩晕同被列为耳鼻咽喉头颈外科三大难治症状，是临床迫切需要解决的顽症[1,2]，也是耳鼻喉科研究生需要重点关注的疾病之一。然而截至目前，耳鸣的发病机制尚不十分清楚，发现和鉴定耳鸣遗传易感基因，将有望为耳鸣的发病机理研究提供线索。因此，指导耳鼻喉科研究生开展耳鸣的全基因组遗传关联研究，将有望提高我们对耳鸣的认知，为探讨耳鸣的遗传学发病机制和防诊治措施的研发提供重要的理论依据[3,4]。同时，也为研究生将来开展耳鸣的临床诊治和耳鸣的发病机理研究提供思路。

笔者从事耳鼻喉科临床工作多年，诊治耳鸣患者数百例。同时，笔者开展了多项耳鼻喉科复杂疾病的遗传易感性研究，积累了一定的科学研究经验。本文拟以笔者指导耳鼻喉科学术型硕士研究生开展的为期两年的噪声性耳鸣全基因组遗传关联研究为例，探讨研究生培养模式。该课题旨在采用全基因组关联研究（Genome-wide association study,GWAS）策略，发现和鉴定与噪声性耳鸣发生发展相关的遗传易感基因。我们针对该研究案例，总结出了四个培训模块：文献调研培训模块、样本招募和采集培训模块、数据分析培训模块和研究总结培训模块，对研究生进行边讲解、边实践的培养模式，重点培养其分析问题解决问题的能力和科学逻辑思维能力，取得了理想效果。期望抛砖引玉，引起同行专家对耳鼻喉科硕士研究生培养的关注，并提出宝贵的意见和建议。

1 培训模块

1.1 文献调研培训模块

文献调研是指根据课题研究需求，通过调查文献获得资料，从而全面掌握和了解研究背景的过程。文献调研是科学研究的第一步，也是极其重要的一步。通过文献调研，可让研究生全面了解课题研究的意义、以往研究的方法、成果以及不足之处等。

文献调研主要分为文献检索和文献综合分析两大部分。首先，研究生需要以自学为主的方式，学会使用PubMed等文献数据库系统性查询相关文献。应指导研究生通过不同的检索途径，如分类号、作者、年份、关键词等，获取有价值的内容，并有效避免错误的检索，减少后续文献阅读的工作量。其次，需要培养研究生综合分析文献的能力。一是需要提升研究生专业英语能力，达到快速、准确进行英文科学论文的阅读。二是引导研究生学会精读和泛读相结合的方式进行文献阅读。并在阅读文献的同时，学会制作文献阅读卡片，记录相关研究的关键信息，包括：论文题目、发表年份、发表杂志、研究设计、主要的研究发现和科学意义及价值等。最后，要注重培养研究生归纳总结的能力，要求研究生根据自己的研究方向，整理出研究思路，适时作出阅读笔记和文献综述。

以噪声性耳鸣GWAS课题为例，该课题的文献调研主要涉及以下两个方面的内容：

1.1.1 GWAS的文献调研

GWAS是一种不基于任何生物学假设的遗传易感基因研究方法和策略。目前，通过GWAS策略，研究人员已成功发现了数千个疾病/性状相关的遗传易感基因[5]。这些遗传变异的发现，已为疾病新的治疗方案的研发提供了候选靶点。

需要引导研究生通过文献阅读，了解和熟悉GWAS一般流程和科学意义。首先，通过阅读GWAS综述文章、查阅GWAS数据库（如GWAS catalog数据库），了解截止目前GWAS概况、GWAS的一般流程、GWAS目前的瓶颈等。

1.1.2 耳鸣遗传易感性研究的文献调研

首先，引导研究生对已有的耳鸣遗传易感性研究进行全面梳理，并记录相关研究的关键信息，以了解耳鸣易感基因研究现状。其次，向研究生讲解耳鸣常见的诱因，包括噪声暴露、年龄老化和耳毒性药物的应用等，不同诱因导致的耳鸣，其易感基因可能存在一定的差异，在进行文献调研时，需要对不同类型的耳鸣进行区分。

1.2 样本招募和采集培训模块

病例和对照人群的招募是GWAS的起始步骤和整个研究成败的关键。本项研究是针对人的血液样本研究，需要向研究对象提前做好宣教工作，并签订知情同意书，且需要留底备案。在研究开展前，针对本项研究，需要研究单位的医学伦理委员会审核通过伦理审查。接下来，应向研究生详细介绍病例和对照样本的招募和采集流程：①招募常年接触职业噪声暴露的人员，对常年接受职业噪声的强度进行分类并测算。②对上述人员进行流行病学调查。制作调查问卷，内容包括姓名、年龄、民族、籍贯、既往史、耳毒药物史、家族史、接触噪声的时间长度和噪声种类等。③对上述人员进行纯音听力检测。根据耳鸣诊断标准筛选出耳鸣病例组和对照组。④在签订“耳鸣研究血液样本采集知情同意书”后，进行血液样本的采集。⑤使用单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism,SNP）芯片分型平台，对DNA样本进行全基因组SNP分型。介绍样本采集流程后，研究生需要实地参与现场调查和样本的招募与采集工作。低年级研究生可以对采集数据进行整理，如将姓名、年龄、噪声暴露的时间、纯音测听检查结果、耳鸣的特征等进行信息录入，高年级硕士研究生可将整理的样本信息数据进行流行病学统计分析，可参照其他噪声暴露调查文献进行归纳总结。

1.3 数据分析培训模块

GWAS策略的一个显著特点是数据量大，对研究人员的数据分析能力的要求较高。在数据分析培训模块，由于医学研究生计算机编程能力和数据统计能力较弱，需要进行正确引导，同时进行短期培训，使研究生达到熟练掌握Linux操作系统最基础的操作。

GWAS的数据分析主要分为三个部分：数据质量控制、SNP基因型的推算和遗传关联分析。

1.3.1 数据质量控制

质量控制分为针对SNP的质量控制和针对个体的质量控制[6]。均使用PLINK软件（1.07版本）操作。这个步骤，需要向研究生讲解每个质量控制步骤的内涵。例如，针对离群个体的去除，需要研究生掌握离群个体的定义和计算方法，以及去除离群个体的原因。离群个体需要去除的原因在于：离群个体的存在，将导致病例-对照人群混杂或人群分层等现象，最终导致研究产生假阳性结果[7]。

1.3.2 SNP基因型的推算

SNP基因型的推算，也称SNP填补。需要研究生了解其基本原理和操作流程。

1.3.3 遗传关联分析

遗传关联分析主要分为三个步骤：确定需校正的混杂因素、遗传关联分析和关联结果的判读。

1.4 研究总结模块

耳鼻喉科学术型研究生培养的目标之一是熟悉科学研究的基本流程和环节。数据整理和结果汇总是科学研究必须完成的任务。带教导师主要负责引导和把关，研究生可先以实验记录的形式将结果整理，逐步训练后，再以标准的科学论文格式进行中文写作训练。如研究生具有一定的英文写作能力，可适当进行英文写作训练。科学论文规范性是研究生写作时最容易忽视的，需要加强引导和培训。科学论文主体主要有：引言、方法、结果和讨论四个部分。以本课题论文为例，引言部分需要通过整理文献调研模块的成果，系统总结耳鸣的概况、耳鸣的易感基因研究概况以及耳鸣易感基因研究的意义。方法部分需要详细回溯整个研究过程中涉及到的人群、实验方法和统计方法。方法需要严格遵守科学规范，并检查是否符合医学实验设计原则。结果部分，需要逻辑完整的描述科学发现，并与以往研究结果进行详细比较。新的科学发现需要图、表的支持，以增强文章的可读性。讨论部分首先要总结本文的主要发现，即发现了噪声性耳鸣新的易感基因，其次要对发现的易感基因可能的机理进行讨论，需要研究生详细阅读相关文献，了解耳鸣的发病机理及易感基因的功能，进行一定的理论推导，然后对研究的优缺点进行系统总结，本课题的优点在于病例-对照来自噪声背景相似的环境等，缺点在于病例-对照的样本量仍较少等，最后需对研究成果的意义进行讨论，我们发现的噪声性耳鸣的易感基因，将有望为耳鸣的发病机理研究提供线索，为耳鸣防诊治措施的研发提供候选靶标。

2 研究生能力培养

在四个培训模块基础上，我们着重培养研究生两个方面的能力，即分析问题解决问题能力和科学逻辑思维能力。

2.1 分析问题解决问题能力培养

研究生需要运用知识分析问题、解决问题，重点在于不断通过启发诱导，提高其独立分析问题解决问题的能力。例如，在数据分析培训模块，研究生可能会面临程序无法运行的问题，研究生应首先自己分析出现该问题的可能原因（文件格式不对、运行环境不对或者命令操作不对等），并自行根据可能的错误原因进行纠正；如仍未解决问题，可与高年级硕士研究生讨论解决或询问带教导师。在研究总结模块，研究生可能面临结果难以解释的问题，如以往研究中与耳鸣显著相关的位点，在本研究中没有得到验证，研究生应首先核查数据，然后阅读相关文献，查询该现象在以往的GWAS中是否存在，并寻找可能的缘由。

2.2 科学逻辑思维能力培养

研究生处于科研起步阶段，在培养研究生的全过程均需要注重科学逻辑思维能力的培养，因此在四个培训模块均需要有意识地教育研究生科学逻辑思维能力的重要性。例如，在文献调研培训模块中，需要指导研究生进行精读文献的训练，使其了解并学习以往经典研究的整体逻辑及研究细节。在研究生深刻理解以往研究工作的基础上，引导研究生对以往研究工作的缺陷进行思考，并提出改进意见。又如，在研究总结模块中，指导研究生对每个结果，使用规范的科技论文以图表形式展示，并引导其思考，每个结果能够推导出什么结论，结果和结果间的逻辑关系如何等。由此，提升研究生科学逻辑思维能力。

综上，通过上述四个模块培训和两种能力培养，研究生能够完整体会科学研究的整个过程：课题设计（文献调研）、样本招募和采集、数据分析和结果汇总（研究总结），为其将来进一步的医学科学研究奠定坚实的基础。未来我们将根据上述模块，培养出更多的、合格的具有一定科研能力的耳鼻喉科研究生，为耳鼻喉科科学研究提供更多的基础性成果。