新生儿肠道耐药菌株基因变异起源

郝 璐，陈秋燕，余丹丹，周 庆

（1.深圳市宝安区石岩人民医院，广东 深圳 518108；2.深圳市宝安区人民医院中心实验室，广东 深圳 518101）

1 耐药菌对人体的危害

耐药菌，顾名思义就是指对抗生素不敏感甚至完全丧失敏感性的细菌，它的出现使得抗生素对细菌的治疗效果完全丧失，增加了感染性疾病的治疗难度。在人类发现青霉素以来，抗生素在人类的应用越来越广泛，这就使得细菌的耐药性逐年增加。现阶段，临床上应用的抗生素种类超过200中，平均每年会增加10中以上，但是由于抗生素在疾病治疗、畜牧养殖等领域的滥用，使得每个抗生素投入使用几年时间内，便会出现相应的耐药微生物。研究人员指出，倘若临床继续滥用抗生素，且人们没有研发出新的抗生素，那么很多感染性疾病将面临无药可治的窘境，人类也将回到青霉素未被发明的日子。

2 人类肠道中的耐药菌和耐药基因

研究表明，当前在人的整个发育阶段均可发现耐药菌的身影，这对人类的健康产生了极大的威胁，一旦人体步入老年或者免疫力低下时，机体发生感染的概率便大大增加。当前，耐药菌在成人和儿童肠道内均能够分离出来，通过分析0～5岁的儿童粪便可以发现，分离出产ESBLs肠杆菌科达到59%，每一株菌至少对两种抗生素耐药，同时，在这些检出的菌株中，喹诺酮类耐药基因qnr、氨基糖苷类耐药基因aac（6’）-ib携带率分别高达66%和43%。有学者对4～12个月正常儿童进行大肠杆菌的分离以及耐药菌测试，结果显示分离出的大肠杆菌对复方新诺明、盘尼西林、四环素的耐药率均高达45%以上。同时，借助PCR技术来对儿童粪便中的菌群进行检测，结果发现很多四环素类抗性基因tetB、tetM、tetQ及大环内酯类抗性基因ermB和ermF在内的耐药基因。

研究表明，新生儿肠道菌群的定植从胎儿时期便已开始，胎儿首先和母体子宫内的少量微生物接触。在胎儿娩出后，新生儿肠道内的微生物环境会和其密切接触的外环境之间产生影响。对于正常顺产的新生儿，其肠道内微生物菌群可能随着母体阴道以及乳液中的微生物进行传输，而对于剖宫产的新生儿，其肠道内微生物族群可能来自其与环境密切接触的微生物。新生儿倘若通过母乳进行喂养，那么母乳中的微生物对新生儿的肠道菌群具有十分密切的影响。有研究指出，部分新生儿胎便中可检测到葡萄球菌、肠球菌、链球菌以及多种四环素类及β-内酰胺类耐药基因，这就意味着耐药菌在新生儿肠道菌群形成初期就已经伴随着正常菌群进入肠道之中。

3 新生儿肠道及粪便耐药基因检测

人体的肠道包含着各种各样的微生物，参与人体的正常生理活动，并直接影响着人体的健康，但是随着近年来抗生素的大量食用，很多儿童肠道内定植了大量的抗生素耐药菌甚至多重耐药菌，造成各种感染性疾病，严重威胁人类的健康。新生儿肠道菌群建立的过程中，由于接触外界环境以及外界输出，使得这些菌群在肠道内定植下来，但是倘若新生儿接触的环境中存在耐药菌，那么这些耐药菌很有可能随着正常的微生物进入到肠道之中，稳定且长期存在，甚至作为人体肠道的共生菌持续的存在于人体肠道当中。

在进行新生儿肠道和粪便耐药基因的检测时，选择天津市中心妇产医院产科的剖宫产新生儿，新生儿不存在基础疾病，无抗生素应用史。

在进行本次研究时，将新生儿出生后3 h的第一次粪便以及出生后72h的粪便进行采集，作为本次研究样品，在新生儿排便于纸尿裤上后，通过粪便采集管收集2 g左右的粪便，选择中间的固体部分并置于冰盒当中，迅速送往实验室。其次还要进行母体羊水以及初乳的采集。在母亲行剖宫产手术时，由手术医师在无菌操作下采集10 mL羊水，同样放入冰盒后送往实验室。初乳的采集也是一样，在采集前需要用碘伏及酒精对乳头进行消毒。另外，还需要对空气中的微生物进行采集。在进行微生物的采集时，选择3个病房，每个病房选取三个部位放置BHI培养皿，在空气中暴露20 min，收集完毕后置入冰盒，送往实验室后保持环境温度37℃，培养24 h。

在完成样品的采集之后，对新生儿胎便中的菌群数量进行计数，并通过PCR技术来对新生儿胎便中的耐药基因进行检测，并建立耐药基因的标准曲线。其次，对接触环境样品中的耐药基因进行PCR技术检测，统计并记录其初乳中的均落数量和耐药基因、接触空气中的耐药基因以及羊水中的耐药基因，并采用SPSS 19.0统计学软件以及x2检验来对统计结果进行统计学分析。

实验结果表明，在新生儿第一次粪便中没有检出具有统计学意义的微生物数量，而在72h后的粪便中，可以发现有99%的细菌是不可培养的。在第一次新生儿粪便检测中，没有检测出明显的耐药基因，而在第二次粪便检测中，已经能够发现多种类型的耐药基因。单一耐药基因占所有研究对象的27.7%，两种耐药基因的粪便占所有研究对象的37.8%，三种耐药基因粪便数量占所有研究对象的17.1%，本次检测中，粪便中最多有四种耐药基因，占所有研究对象的8.5%。

同时，针对母亲初乳、羊水以及接触环境的检测表明，在母乳中可以检测出丰富的耐药基因，其中含有一种耐药基因的样品31.1%，含有两种耐药基因的样品占比高达40以上，最多可检测中含有四种耐药基因的母乳样品3.3%。而在所获得的的羊水样本中，并没有检测到微生物，同时也没有检测到相应的耐药基因，这说明在进行羊水取样时没有出现污染，同时羊水不会对新生儿肠道耐药菌群的定植提供支持和运输。另外，在对所接触空气的微生物进行培养之中，检测出其中有四种耐药基因，分别为ampC、mecA、ermB、tetW，其中检出率最高的耐药基因为ampC，检出率高达41.7%。

本次实验结果表明，新生儿第三天的粪便中已经含有多种类型的耐药基因，这些耐药基因完全覆盖了现阶段人类常使用的五大抗生素，即β-内酰胺类、氨基糖苷类、大环内酯类、磺胺类及四环素类，其中β-内酰胺类抗生素的耐药基因检测率最高。在新生儿第三天的粪便中便可检测中基因，这就意味着新生儿的肠道耐药基因污染已经十分明显，可以考虑是羊水、母乳以及空气中微生物的定植所致。

对于母亲羊水的检测结果提示，羊水中并未检测中明显的微生物以及抗生素耐药基因，可以考虑在本次研究的环境下可培养的菌并为来自母亲羊水，但是本次研究也不能完全排除不可培养的细菌或耐药基因通过羊水传递给新生儿。而对母亲初乳和空气的检测提示可检测中多种耐药基因，尤其是母亲初乳，所监测的耐药基因均有不同的检出率。

4 新生儿肠道耐药菌株基因变异分析

在进行新生儿肠道耐药菌株基因变异的分析时，在全基因组水平研究基因突变导致肠道耐药菌株产生的分子机制十分有必要。通过给予深度测序的双重测序和BS测序技术，能够借助测序检测基因突变和基因表观修饰变化，并开发出相应的数据分析算法。

选择20组正常的足月新生儿和母亲，采集羊水、新生儿的第一次粪便、第三天粪便。

对于获取的羊水样本，采用十六烷基三甲基溴化铵法来进行基因组DNA的提取，然后用特异性引物将基因特定的V3-V4区进行扩增，获取印务序列。将PCR产物进行电泳检测，调整其浓度，并将目的条带使用胶回收试剂盒回收产物。再使用Q-PCR定量来进行测序，将测序后的数据删除其标签和引物序列，使用flash技术对样品的序列进行拼接，得到初始的tags，将获取的tags序列和数据库中的序列进行比对，最终得到有效的数据。

研究结果显示，新生儿第一次粪便、新生儿第三天粪便、母亲初乳以及羊水这四种样品中均含有较多的细菌，按照门水平，可以发现四组样品中海油拟杆菌门、放线菌门及变形菌门，而按照属进行分类，可以发信啊四组样品中含有较多的盐单胞菌、不动杆菌以及希瓦氏菌。同时，这四组样品中均含有较多的共有菌属，这就意味着新生儿肠道菌群既来自于母亲的羊水，也来自于母亲的初乳。

同时，Amova分析结果显示，母亲羊水和新生儿第一次粪便中的菌群一致，因此，本次研究结果表明，新生儿在胎儿时期就接受了羊水中的菌群，并且这些菌群在胎儿时期便在肠道内定制。但是两组样品中都没有检测出细菌或者耐药基因，考虑这些检测出的细菌不具有培养性，或者说本次研究提供的培养环境不适合以上细菌的培养。同时，本次研究表明，母亲初乳中检测出较多的耐药基因以及细菌，说明母亲初乳是新生儿肠道耐药菌株变异的重要来源。