减味寿胎丸对药源性卵巢功能损伤大鼠干预时机的探讨*

★ 管雁丞 黄长盛 倪张俊 指导：罗颂平（.深圳市中医院妇产科 广东 深圳 58000；2.华中科技大学协和深圳医院（深圳市南山区人民医院）中医（风湿）科 广东 深圳 58052；.广州中医药大学第一附属医院妇科 广州 50405）

1 材料与方法

1.1 动物 SD雌性SPF级大鼠，重约220～250g（广东省动物实验中心，动物合格证号，SYXK（粤）2008-0001）。饲养于广州中医药大学SPF级动物房。

1.2 试药 减味寿胎丸：菟丝子、桑寄生、续断按2：1：1比例混合，采用醇提与水提法，混合总提物，提取率为45%（广东优力生物科技有限公司完成，样品批号：201111030201-201111030204）。按人与大鼠体表面积折算系数6.25进行换算，即大鼠给药剂量为1.875g/kg/d；低剂量组为1倍等效剂量，高剂量组为4倍等效剂量。

戊酸雌二醇（补佳乐）片（1mg/片，DELPHARM Lille S.A.S产，生产批号：278A），配置成0.5mg/mL药物浓度。雷公藤多苷悬浮液（黄石飞云制药有限公司，产品批号：20151203），配置成浓度为75mg/kg的悬浮液。

1.3 分组与方法 适应性喂养1周后选取有正常动情周期大鼠90只，随机分成正常组、前期干预模型组、前期干预补佳乐组、前期干预中药高、低剂量组，后期干预模型组、后期干预补佳乐组、后期干预中药高、中药低剂量组，每组各10只。

1.4 实验方法 正常组分别于上午9时及下午3时灌服3mL生理盐水，连续30天；早期干预模型组上午9时灌服GTW，下午3时灌服生理盐水；早期干预用药组上午9时灌服GTW，下午3时灌服减味寿胎丸或戊酸雌二醇，均连续30天。后期干预模型组在定时连续灌服GTW30天后，改予3mL生理盐水，晚期干预用药组改予减味寿胎丸或戊酸雌二醇，均连续30天，共60天。

1.5 观测指标

1.5.1 动情周期的变化 观察方法[1]如下：动情前期：全部见有核上皮细胞，偶见少量角化细胞。动情期：全部见无核角化细胞，间有少量白细胞。动情后期：细胞成分多，可见白细胞，角化细胞及有核上皮细胞。动情间期：可见有大量的白细胞及少量上皮细胞和粘液。

1.5.2 血清FSH、LH、E2、INHB、AMH的检测 大鼠最后一次灌胃后1～5天内，选择非动情期腹主动脉取动脉血、处死。血清FSH、LH、E2以RIA法测定（广州中医药大学基础医学院核医学实验室完成）；血清INHB、AMH以ELISA法测定。

1.5.3 卵泡计数 大鼠处死后摘取双侧卵巢、子宫，并尽可能的剔除粘附脂肪等组织。将左侧卵巢在电子秤上称湿重后，计算卵巢指数、子宫指数。计算公式如下：

卵巢指数、子宫指数=卵巢、子宫重量/大鼠体重×100%

同时，将右侧卵巢标本用10%多聚甲醛固定，包埋、切片，观察卵泡计数。各级卵泡分类标准描述参阅文献[1]。原始卵泡计数以卵母细胞核作为标记物。窦前卵泡和窦状卵泡计数以卵母细胞核仁为标记物观察每张切片。按照上述方法，计数每个标本卵泡及黄体数。采用单盲法独立观察所有切片。

1.6 统计学方法 采用SPSS 22.0进行数据处理和统计分析。以P＜0.05为差异有统计学意义

2 结果

2.1 动情周期 以两个动情周期8～10天作为观察点。结果表1-2。结果表明，前期干预模型组随着造模时间的延长，在D11-D20已出现过半大鼠动情周期的紊乱、延长，到最后全部大鼠均出现动情周期的变化。前期干预西药组及减味寿胎丸高、低剂量均可使部分大鼠动情周期恢复，其中，高剂量组有一半大鼠恢复正常的动情周期。后期干预模型组随着造模时间的延长，动情周期未能恢复。后期干预西药组及减味寿胎丸高、低剂量均可使部分大鼠动情周期恢复，但统计学上均无意义（P＞0.05）。

表1 大鼠前期干预动情周期的变化（n=10） 只

表2 大鼠后期干预动情周期的变化（n=10） 只

2.2 血清性激素水平变化 前期干预西药组可明显升高E2水平；前期干预西药组、减味寿胎丸高、低剂量组均可明显降低FSH、FSH/LH比值的水平，三组组间比较无差异；后期干预各治疗组及各组LH组间比较均无明显差异。

2.3 血清细胞因子比较 中药低剂量组可明显升高INHB、AMH水平，前、后干预各治疗组均未见明显变化。

表2 大鼠前、后期干预血清性激素的变化（，n=10）

表2 大鼠前、后期干预血清性激素的变化（，n=10）

注：与正常组比较，★P＜0.05。与前期模型组比较，*P＜0.05。与后期模型组比较，ΔP＜0.05。

组别 E2/pg·mL-1 FSH/mIU·mL-1 LH/mIU·mL-1 FSH/LH正常组 7.61±7.51 0.65±0.45 0.5±0.25 1.33±7.54前+模组 1.48±1.1★ 1.59±0.9★ 0.98±0.69 2.29±1.91★前+西组 4.73±4.54★* 1.10±0.21★* 0.89±0.15 1.22±0.44*前+中高组 2.76±3.08★ 0.95±0.15* 0.91±1.76 1.13±0.87*前+中低组 1.57±1.43★ 1.2±0.16★* 0.96±0.13 1.24±0.05*后+模组 1.10±2.14★ 1.26±0.34★ 0.73±0.44 1.24±0.09★后+西组 2.05±2.48★ 1.12±0.45★ 0.89±0.27 0.24±0.09后+中高组 2.52±3.08★ 1.11±0.35★ 0.82±0.22 1.33±0.18后+中低组 2.21±2.85★ 1.07±0.25★ 0.87±0.17 1.23±0.64

表3 大鼠前、后干预血清细胞因子的变化（，n=10） ng/mL

表3 大鼠前、后干预血清细胞因子的变化（，n=10） ng/mL

注：与正常组比较，★P＜0.05。与前期模型组比较，*P＜0.05。与后期模型组比较，ΔP＜0.05。

组别 INHB AMH正常组 41.1±5.17 10.06±1.23前+模组 35.81±3.61★ 8.4±0.94★前+西组 34.23±4.98★ 8.18±1.33★前+中高组 36.08±4.61★ 8.75±1.19★前+中低组 39.74±3.52★* 9.62±1.74*后+模组 33.35±4.62★ 8.65±1.15★后+西组 33.38±6.11★ 8.27±1.11后+中高组 37.18±1.95★ 7.94±0.75后+中低组 31.37±5.78★ 8.38±0.79

2.4 大鼠卵巢指数、子宫指数变化 前期干预中药低剂量组可明显升高卵巢指数，前后期干预组均未见子宫指数明显升高。

表4 大鼠卵巢指数、子宫指数的变化（，n=10）%

表4 大鼠卵巢指数、子宫指数的变化（，n=10）%

注：与正常组比较，★P＜0.05。与前期模型组比较，*P＜0.05。与后期模型组比较，ΔP＜0.05。

组别 卵巢指数 子宫指数正常组 0.024±0.002 0.23±0.084前+模组 0.018±0.005★ 0.203±0.102前+西组 0.023±0.003 0.203±0.06前+中高组 0.020±0.003 0.15±0.015★前+中低组 0.026±0.005* 0.164±0.031★后+模组 0.014±0.053★ 0.169±0.06★后+西组 0.019±0.05Δ 0.15±0.023★后+中高组 0.023±0.003Δ 0.203±0.074后+中低组 0.017±0.005Δ 0.162±0.047★

2.5 大鼠卵泡计数比较 大鼠生长卵泡的比较：前期干预西药组未能明显使生长卵泡数量增加，减味寿胎丸高、低剂量组可使生长卵泡增加，但统计学上无意义。后期干预中药高剂量组可明显使生长卵泡数量增加。前期干预西药组可使成熟卵泡/卵泡总数比值明显升高；后期干预各组均可使比值升高，但无统计学意义。各组黄体数组间比较无明显差异。

表5 大鼠前、后期干预卵泡计数的比较（，n=10）个

表5 大鼠前、后期干预卵泡计数的比较（，n=10）个

组别 生长卵泡 成熟卵泡/卵泡总数 黄体数正常组 12.5±5.66 0.25±0.06 5.4±3.03前+模组 11±7.02 0.17±0.08 4.2±1.93前+西组 8.8±6.56 0.41±0.26★* 3.5±2.59前+中高组 11.4±7.96 0.21±0.14 4.6±1.65

（续表）

3 讨论

“治未病”最早见于《黄帝内经灵枢·顺逆》，体现了中医学预防为主的思想，是中医理论体系的重要组成部分，在后世亦得到了不断发展和完善，它包括了“未病先防”“既病防变”“瘥后防复”三个方面，三者的重点在于“防”。所谓未病先防，即着眼于未雨绸缪，保身长全，预防疾病的发生，是“治未病”的第一要义。

笔者研究团队已多次重复并成功建立药源性卵巢功能损伤大鼠模型，结果显示75mg/kg，连续用药30天模型稳定[2]；减味寿胎丸拮抗修复卵巢功能损伤效显且三月龄性成熟大鼠干预效果最佳[3]。故本实验基于“治未病”学说，将实验设立为前期干预及后期干预两个部分。前期干预即在灌服雷公藤的造模同时，给予治疗药物干预；后期干预即造模成功后，给予治疗药物干预，以观察前期干预与后期干预的差异性，进一步探讨雷公藤致卵巢功能损伤大鼠最佳干预时机，以期指导临床用药，减少药物的副作用，提高药物利用度。

结果表明，前期干预组，减味寿胎丸可使3月龄大鼠约半数动情周期恢复；可使FSH、FSH/LH明显降低，E2、AMH、INHB水平明显升高；可使卵巢指数明显升高；可使成熟卵泡/卵泡总数比值明显升高；可使生长卵泡增加，但统计学上无意义。后期干预组，中药高剂量组可明显使生长卵泡数量增加，未见明显性激素及细胞因子的明显变化。可见，前期干预对于卵巢功能损伤的修复效果更显著，后期干预各组虽有效，但均无显著性改善。

综上所述，减味寿胎丸前期干预拮抗修复药源性卵巢功能损伤显效，后期干预无效。