rhGLP-1（7-36）联合他克莫司对人肝细胞Akt的作用研究*

姚瑶，王宏宇，徐春

（1.锦州医科大学 研究生学院，辽宁 锦州 121001，2.中国人民解放军总医院第三医学中心，北京 100039）

器官移植术后糖尿病是器官移植后常见的并发症之一。研究提出器官移植术后糖尿病的发生与器官移植术后患者常用的免疫抑制剂他克莫司、环孢素有关，其中，他克莫司相较于环孢素更容易引起器官移植术后糖尿病[1]。他克莫司引起器官移植术后糖尿病的机制尚不清楚，有研究发现，他克莫司增加正常大鼠的血糖浓度具有时间及浓度依赖性[2]，尤其是与时间有关。有学者将他克莫司短期注入正常健康人体中，发现胰岛素敏感性增加，同时对胰岛素的分泌无影响[3]。SHIVASWAMY等[4]用他克莫司短期处理正常的大鼠，大鼠会出现高血糖，并伴有轻度的高胰岛素血症，即大鼠体内有轻度的胰岛素抵抗；用他克莫司长期处理大鼠后，大鼠仅出现高血糖，未再出现高胰岛素血症，即大鼠已丧失胰岛素分泌功能，该研究提示他克莫司引起糖代谢紊乱与时间有关。还有研究提出他克莫司具有促进胰岛细胞凋亡，抑制胰岛素分泌，增加胰岛素抵抗的作用[5]。目前，研究多集中于胰岛B细胞，对胰岛外的细胞（如肝脏细胞）研究较少。但笔者前期研究发现他克莫司能够促进肝细胞丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Akt的磷酸化，Akt的磷酸化能导致肝脏脂质代谢紊乱，提示他克莫司引起肝细胞中胰岛素抵抗可能与胰岛素信号通路中关键蛋白Akt的活化有关[6]。

2016年器官移植术后糖尿病诊治指南指出，器官移植术后糖尿病与2型糖尿病的发病机制方面存在某些交叉，因此在治疗上与2型糖尿病类似。目前，二甲双胍和DDP-4抑制剂可能是理想的首选药物[7]。其中，DPP-4抑制剂是通过增加体内胰高血糖素样肽（glucagon-like peptide 1,GLP-1）浓度来降低血糖。GLP-1能从多方面降低血糖：延缓胃排空，增加饱腹感；促进葡萄糖依赖性的胰岛素分泌，抑制胰高血糖素的释放；增加葡萄糖的利用，改善胰岛素敏感性等。GLP-1对胰岛及胰岛外细胞均有作用，比如，在肝脏细胞中，GLP-1能促进肝脏中糖原的合成，减少肝脏脂肪的累积[8]。因此可推测，GLP-1能改善他克莫司引起的肝脏脂质的紊乱，该过程可能与Akt有关。GLP-1的主要活性成分为rhGLP-1（7-36），因此，本研究拟用rhGLP-1（7-36）联合他克莫司共同作用于人正常肝细胞，通过检测Akt的表达，证明GLP-1尚不能通过影响Akt蛋白来改善他克莫司引起的肝脏脂代谢紊乱。

1 材料与方法

1.1 细胞、药物与试剂

rhGLP-1（7-36）购自上海仁会生物制药股份有限公司，人肝细胞系HL-7702细胞株购自上海中国科学院细胞所，胎牛血清（fatal bovine serun,FBS）购自杭州四季青生物工程有限公司，RPMI 1640培养基购自英国Gibco公司，他克莫司粉末、兔来源p-AktThr308单克隆抗体、兔来源p-AktSer473单克隆抗体、辣根过氧化物酶（horse radish peroxidase,HRP）标记抗鼠 /兔 IgG 购自美国 Cell Signaling Technology公司，鼠来源actin单克隆抗体购自美国Abcam公司，脱脂奶粉购自上海碧迪医疗器械有限公司，其他常用试剂为进口或国产分析纯化。

1.2 仪器与设备

二氧化碳CO2恒温细胞培养箱（美国Thermo Forma公司），化学发光凝胶成像系统（美国Aplegen公司），Synergy HT 酶标仪（美国Bio Tek公司）。

1.3 方法

1.3.1 细胞分组及处理 培养人肝细胞系 HL7702细胞株至对数生长期，按5×105个/ml均匀接种于60 mm培养皿上，随机分为对照组、F组、G组、GF组。于37℃、5% CO2湿化培养箱中培养24 h，弃去旧培养基。F组用含5 mg/L他克莫司的10% FBS的RPMI 1640 培养基处理 90 min ；G 组用含 100 nmol/L rhGLP-1（7-36）的相同培养基处理90 min；GF组用含 5 mg/L 他克莫司和100 nmol/L rhGLP-1（7-36）的相同培养基处理90 min；对照组用等量的相同培养基处理相同时间。

1.3.2 Western blotting 检测 Akt蛋白的表达水平 各组细胞处理后，弃掉旧培养基，分别用预冷的磷酸盐缓冲液洗2遍。每组细胞加入适量RIPA裂解液（内含终浓度为1 mmol/L的苯甲基磺酰氟、氟化钠、正钒酸钠），4℃放置15 min。充分裂解后，收集裂解液至离心管中，16 000 r/min 离心 20 min。收集上清液，蛋白质定量（BCA法）测定蛋白浓度并分装。制备8%分离胶和5%浓缩胶（SDS-PAGE），等量蛋白与4×上样缓冲液混合，沸水中加热5 min至蛋白变性。蛋白上样，电泳。再于100 V电压下将蛋白转至硝化纤维膜上。将膜用含5%脱脂奶粉的封闭液孵育3 h，用TBST（Tris-HCl缓冲盐溶液加 Tween-20）洗 5 min，孵育一抗，4℃过夜。TBST洗膜3次，每次5 min，室温下孵育二抗1 h。再次用TBST洗膜3次，每次5 min。用化学发光凝胶成像系统进行检测，用Image J软件进行灰度分析。所有实验重复3次以上。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

人肝细胞系HL7702细胞经过不同处理组处理后，不同组中p-AktThr308蛋白的表达有差异（P＜0.05），进一步与对照组比较，各实验组p-AktThr308蛋白表达均升高（P＜0.05）（见图1和表1）；不同组中p-AktSer473的表达差异无统计学意义（P＞0.05）（见图2和表1）。

图1 不同处理组p-AktThr308蛋白的表达

表1 不同处理组对Akt蛋白的影响 （±s）

表1 不同处理组对Akt蛋白的影响 （±s）

注：†与对照组比较，P ＜0.05。

组别 p-AktThr308 p-AktSer473对照组1.00±0.00 1.00±0.00 F组1.54±0.27† 1.22±0.13 G组1.73±0.31† 1.22±0.18 GF组1.91±0.46† 1.28±0.31 F值 6.521 1.648 P值 0.007 0.231

图2 不同处理组p-AktSer473蛋白的表达

3 讨论

丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Akt是蛋白激酶AGC家族中一员，与细胞的调节如细胞的生长、存活、增殖、凋亡、代谢及血管形成密切相关[9]。Akt的活化受到PI3Ks的调节，PI3Ks能产生脂类的第二信使PIP3。PIP3直接与Akt的PH结构域结合，从而将Akt征募至细胞膜上，使Akt活化。Akt的完全活化与Ser473及Thr308位点的磷酸化有关。本质上来说，Akt的活化是一个磷酸化与脱磷酸化的平衡过程。促进Akt磷酸化的激酶主要有PDK1与mTORC2：PDK1的PH结构域，直接与PIP3结合，使Thr308磷酸化，mTORC2能直接磷酸化Ser473。使Akt脱磷酸化的磷酸酶有以下几种：脂类磷酸酶PTEN能使PIP3脱磷酸化，抑制Akt活性；PP2A酶、PHLPP1能使Akt脱磷酸化。而近年来发现他克莫司的结合蛋白——FKBP51能促进PHLPP1与Akt结合使Akt脱磷酸化，提示他克莫司可能通过与FKBP51结合抑制Akt的脱磷酸化，提高细胞内磷酸化Akt的水平[10]。活化的Akt从胞膜转移至细胞内，并且磷酸化其下游分子，在众多下游分子中，与细胞代谢相关的蛋白主要包括：GSK3、FOXO1以及Akt亚基160[11]。其中，GSK3已被证实通过脂质合成的关键因子SREBP调节脂肪的合成[12]。提示Akt能通过影响下游的GSK3来调节脂肪合成，与ONO等[13]肝脏中过表达Akt能引起肝脏脂肪变性及高甘油三脂血症的研究相符合。本研究发现，他克莫司单独作用于人正常肝脏细胞时能促进Akt的磷酸化，提示他克莫司可能会因此引起肝脏脂质代谢紊乱。

GLP-1是人体内降低血糖的一种多肽。进食后，受营养物质的刺激，胃肠道黏膜上的朗格汉斯细胞（L细胞）分泌GLP-1。GLP-1发挥降糖作用后，很快被DPP-4酶水解终止效应。目前市面上以GLP-1为基础的药物包括GLP-1R激动剂（艾塞那肽、利拉鲁肽等），以及DPP-4酶抑制剂（西格列汀、沙格列汀、利格列汀、阿格列汀、维格列汀、吉格列汀）[14]。有研究发现，这些药物不仅能调节血糖，也能改善肝脏中胰岛素抵抗[15-17]。TAHER等[18]发现在胰岛素抵抗的小鼠模型中，艾塞那肽能抑制果糖喂养引起的血脂紊乱及肝脏极低密度脂蛋白的过度表达。尽管如此，GLP-1对肝脏脂肪代谢的机制仍不清楚，有学者提出GLP-1直接调节肝细胞内的胰岛素信号通路，降低肝脏脂肪变性[16]。肝脏脂肪合成的增加与异位脂质的累积有关：肌肉中因异位脂质累积，将已处理的糖传递给肝脏，导致肝脏的脂肪合成增加，引起高脂血症，随后巨噬细胞进入脂肪组织引起脂肪分解，由于脂肪酸的脂酰化，能进一步增加肝脏甘油三酯的合成，该过程大部分与肝脏中胰岛素信号通路无关。本研究中用rhGLP-1（7-36）联合他克莫司作用于人正常肝细胞时发现Akt的磷酸化仍然升高，说明GLP-1改善他克莫司引起的肝细胞脂质紊乱与Akt蛋白无关，其可能通过影响其他蛋白来降低肝脏脂质的累积。本研究仅研究GLP-1对他克莫司短期作用的影响，且只研究Akt蛋白，因此还需继续研究他克莫司长时间作用于肝细胞后，GLP-1是否能通过Akt改善他克莫司引起肝脏脂肪代谢的紊乱；并继续研究胰岛素信号通路中的其他蛋白，进一步确定GLP-1能否通过胰岛素信号通路改善他克莫司引起的肝脂质紊乱。