巢式病例对照研究文献案例分享

郑丽娜，刘丽萍

2019年Arterioscler Thromb Vasc Biol发表了一篇巢式病例对照研究“Association Between Fatty Acids of Blood Cell Membranes and Incidence of Coronary Heart Disease——A Case-Control Study Nested in the PREDIMED Trial”。通过该研究探讨巢式病例对照研究的相关内容。

1 研究介绍

1.1 研究背景 脂肪酸作为细胞膜的主要成分，一旦从细胞膜上释放，可转化为生物活性分子，对一些疾病具有调控作用。大量证据表明心肌细胞细胞膜中酰化的长链ω-3脂肪酸是冠心病中缺血性损伤心肌的主要保护因子。研究证实，红细胞膜中的ω-3状态是心肌细胞膜ω-3含量的良好替代标志物。最近2项大型流行病学研究报道，红细胞膜中具有高比例长链饱和脂肪酸（very long chain saturated fatty acid，VLCSFA；C20：0，C22：0，C24：0）的受试者心脏骤停的风险较低，并且可能有较低的冠心病患病风险。本研究旨在探究血细胞膜中脂肪酸基线水平和1年变化与具有心血管疾病高风险的老年人群发生冠心病事件之间的关系。

1.2 研究方法 本研究是基于一项多中心、单盲、对照研究的巢式病例对照研究，共纳入7447例有心血管疾病高风险的参与者。由评审委员会裁定发生的冠心病事件，最终有280例发生了冠心病事件，其中，仅136例具有基线血细胞样本（入院第2天空腹采血）。每个病例选择两个对照（272例），病例组和对照组在年龄、性别、BMI、干预和在研究中的持续时间方面均匹配。将其中211例接受了1年随访的受试者（70例病例vs141例对照）纳入1年变化分析。

通过气相色谱测定血样中的脂肪酸谱，每种脂肪酸的量表示为样品中总脂肪酸的百分比。收集饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸、ω-3指数、极长链脂肪酸等变量信息。

1.3 研究结果 在基线，相比对照组，发生冠心病事件的受试者2型糖尿病患病率和吸烟者比例均较高（均P＜0.05）。病例组和对照组血细胞膜中脂肪酸的基线比较，VLCSFA水平，特别是C22：0，C24：0，C22：4n6，C22：5n6，C24：1n9在病例组中显著低于对照组，而C18：1n9cis和C20：1n9的水平在病例组中更高。

对病例组136例患者的基线脂肪酸进行分析，其中模型1为未校正模型，模型2校正了基线中存在显著差异的吸烟与糖尿病两个混杂因素，两个模型结果均显示了C20：1n9每增加1个标准差（standard deviation，SD）与冠心病事件风险增加显著相关，而VLCSFA、C22：0和C24：0每增加1个SD与冠心病事件风险降低显著相关。对病例组70例患者1年后脂肪酸变化水平进行分析，结果显示1年的脂肪酸水平变化与冠心病事件发生之间无明显相关性。

校正年龄、吸烟、BMI、饮酒、休息时间-体力活动和2型糖尿病等混杂因素后的横断面分析显示，C22：0与IL-10呈负相关，Spearman偏相关系数（rs）为-0.16，在C24：0和IL-10之间也观察到类似趋势，但未达到显著水平（rs=-0.14）。以上2种VLCSFA与其他炎症标志物（IFN-γ，IL-1b，IL-6，IL-8）之间无明显相关性。而C20：1n9与上述任何一种炎症标志物均无明显相关性。进一步校正IL-10基线水平后，C22：0与IL-10的1年变化水平呈负相关。

校正年龄、性别、BMI、吸烟、休息时间-体力活动，血脂异常和高血压等混杂因素后横断面分析显示，VLCSFA（OR0.43，95%CI0.23～0.82）、C24：0（OR0.35，95%CI0.17～0.70）与2型糖尿病显著相关。C22：0与2型糖尿病也可观察到类似趋势。

1.4 研究结论 地中海区域心血管疾病高风险的老年人群中，冠心病事件与C22：0和C24：0水平呈负相关，与C20：1n9水平呈正相关。

2 Q&A

Q1：什么是巢式病例对照研究？其优势及在临床研究中的作用是什么？

A1：巢式病例对照研究（nested case control study，NCCS），又称队列内病例对照研究。它往往是基于大规模的随访数据，如队列研究或登记型研究，其病例和对照人群均源于同一个全队列，以所有的队列作为一个整体人群。其研究步骤为：①根据研究目的确定研究队列人群（注意：人群进入队列时均没有发生目标疾病，和队列研究相同）；②收集队列内每个成员的相关信息和生物标本；③预定期间的随访；④确定随访期内发生某疾病的全部病例，组成病例组；⑤随访结束时尚未发生所研究疾病的人群随机匹配一个或多个对照（如1∶1、1∶2等）；⑥对收集的两组成员相关生物标本进行必要的化验；⑦统计分析，计算发病率、OR等。该研究优势为：病例和对照均来自同一队列，可比性好，且两组的暴露资料等均在疾病诊断前收集，一旦结果提示暴露与疾病的相关性，这种相关性符合因果关系推断的时间顺序，观察偏倚也能得到很好地控制。此类研究设计尤其适用于包括复杂的化学或生化分析研究因素的前瞻性研究。

Q2：本研究在数据处理上采用了1个标准差作为增量单位来分析与结果的相关性，该方法是否适用于其他类型研究？

A2：本研究由于其研究内容（脂肪酸）的特殊性，将不同种类脂肪酸含量用其在总脂肪酸中的百分比来表示，并分析了基于1个SD增量，发生冠心病事件的风险变化。但SD是针对具体研究的，当在另一个背景下更换一组研究对象时，其脂肪酸的SD值即发生改变，因此不可能重复该研究并期望找到相同的结果。此外，在常规临床研究中的变量大多数有具体单位及固定范围，故采用1个SD增量对于临床医师来说是没有意义的。如血糖或血压的单位是明确的，如果研究结果提示增加10 mm Hg（1 mm Hg=133.32 Pa）的收缩压会增加脑出血风险，这可在另一项研究中证实，临床医师可参考这些数值作为治疗目标。然而，如果结论是1个SD增量，这样的结论难以重复且基本没有临床应用价值。故认为采用标准差作为增量单位来分析与结果的相关性的作用是有限的，且难以适用于其他类型的研究。

Q3：在进行回归分析时，如何挑选校正因素来设计不同模型？

A3：回归分析主要用于寻找某疾病发生的危险因素、校正混杂因素预测疾病发生等。回归分析有明确的结局变量（因变量）和解释变量（自变量），一些自变量对结局有较大的影响，但并非此次研究的主要目的，此时需设计模型对其进行校正。故校正因素的选择主要取决于研究目的。一般模型1通常为未校正或校正一些不可干预的基本信息（如人口学特征）后的结果；模型2可加入一些在基线分析中存在显著差异的变量，或一些临床上普遍认可的危险因素（尽管基线信息分析中未提示两组间存在显著差异），均可进行校正；模型3可在模型2的基础上再加入一些新型标志物进行校正后分析。