液体活检在胰腺癌中的研究进展

田宏 金锷 郭晓钟 李宏宇

1沈阳市第四人民医院肿瘤内科，沈阳 110030；2北部战区总医院消化内科，沈阳 110016

【提要】 液体活检作为一种新兴技术，主要对循环肿瘤细胞(CTC)、循环肿瘤DNA(ctDNA)及肿瘤来源的外泌体进行检测，具有操作简便、快速、非侵入性、重复性强等优势，在肿瘤的早期诊断、治疗、进展与转移等领域发挥重要作用。本文分析液体活检技术的优势和局限性以及临床应用潜力和发展状况，对该技术在胰腺癌诊断、预测和治疗方面研究进展进行综述。

胰腺癌的肿瘤相关纤维细胞构成的复杂微环境阻碍了药物的传递，也造成了复杂的信号转导环境，并通过分泌各种细胞因子影响其生物学行为[1]。尽管CT、MRI和超声检查等成像技术能够为胰腺癌的诊断提供依据，但无法在早期癌症筛查中提供有价值的信息。糖类抗原19-9(CA19-9)和癌胚抗原(CEA)等常用蛋白质生物标志物在早期胰腺癌诊断中也没有足够的灵敏度和特异度，甚至可能产生假阳性结果。传统的组织活检虽然可以提供有价值的信息，但胰腺组织取样困难、有创，无法重复活检，不适合捕捉肿瘤的整个异质性，不适合分析转移性病变等[2]，这大大限制了实时监测和应用个性化药物的机会。为增加胰腺癌患者的存活率并降低患者负担，采用一种精准、微创和经济有效的手段进行早期诊断、预后分层和肿瘤监测显得至关重要。液体活检是通过检测人体各种体液中的肿瘤相关生物标志物获取疾病相关信息的技术，可以帮助监测疾病进展和治疗反应，并能够预测患者的结局。1994年循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)应用于胰腺癌患者检测[3]，1996年循环肿瘤细胞(circulating tumor cell, CTC)分析应用于胰腺癌患者检测[4]，2014年外泌体分析应用于胰腺癌患者检测[5]，使胰腺癌液体活检分析取得了巨大进步。数字聚合酶链反应和下一代测序等新的分析方法的建立进一步加速了液体活检领域的发展，使胰腺癌基因突变(包括k-Ras、cdkn 2a、tp 53和smad 4)的精确识别和定量成为可能[6]。同时微流体技术的发展及其在生物医学研究中的最新应用也在液体活检的进展中发挥重要作用[7]。

一、液体活检的体液样本

血液是进行液体活检的最常见的体液，包括全血、血浆或血清。从血液中取样是一种简单易行且微创的方法，可用于检测释放进入血液的肿瘤源性成分，但血液中也含有非肿瘤特异性的其他成分，因此采用滤膜法和密度梯度离心法等物理技术或免疫捕获法和微流控芯片等生物技术进行样品富集是非常必要的。富集后样本可以采用测序或染色等方法做进一步检测，能够显著提高检测灵敏度。

胰腺外分泌腺分泌的胰液由于富含肿瘤来源的成分，可用于检测胰腺癌[8]。采用经内镜行腔内引流术或内镜下胆管内引流术的方法从胰液和胆汁中取样，通过浓缩肿瘤源性成分浓度可提高液体活检的灵敏度[9]。由于胰液进入胆管，随后进入十二指肠和大肠，因此粪便也可以成为液体活检的样本来源，但此方面的研究较少，可能是由于该方法的准确性较低。其他体液如唾液、尿液和胸腔积液也可作为检测胰腺癌的生物标志物的样本来源，且多种来源的样本分析能够提供相互补充的信息[6]。

二、液体活检的肿瘤衍生成分

目前应用于液体活检的肿瘤衍生成分主要是ctDNA、CTC和外泌体，这也是胰腺癌最常见的生物标志物。

1．ctDNA：循环无细胞DNA(circulating free DNA, cfDNA)是指细胞凋亡和坏死过程中释放到循环系统中的，或通过细胞直接分泌释放到循环系统中的DNA[5]。ctDNA是肿瘤微环境中的肿瘤细胞凋亡和坏死过程中释放的DNA，也可能是CTC释放的DNA，是肿瘤液体活检极具价值的生物标志物。一般意义上提到的cfDNA包括了正常细胞释放的DNA和ctDNA。肿瘤患者体液中的cfDNA含量一般明显高于健康人，但一些非恶性状况下(例如炎症)的cfDNA也会显著增加，因此需要进行鉴别判断。肿瘤患者cfDNA中ctDNA的占比在个体间具有高度的差异性，这可能反映了肿瘤分期和肿瘤大小的差异。大多数肿瘤细胞释放的ctDNA能够提供多个基因靶点进行直接测定， 可以对肿瘤的基因突变情况进行全面的分析[8]。ctDNA在体液中的半衰期很短(一般几个小时)[6]， 一旦释放到体液中，会被各种机制迅速清除，包括核酸酶作用、肾脏摄取、肝脏和脾脏以及巨噬细胞的降解等。因此针对ctDNA的液体活检具有很大的挑战性，检测的结果仅代表肿瘤的当前状态，需要进行动态的实时监测。

ctDNA在胰腺癌晚期诊断中是一种很有前景的生物标志物，CTC和CA19-9分析能更好地预测晚期胰腺癌患者的预后生存[10]。高水平的ctDNA与胰腺癌患者的生存率下降显著相关[11]，也与化疗后或化疗期间胰腺癌的进展风险增加和手术后复发风险增加密切相关[12-13]。但ctDNA分析并不能很好地用于检测早期胰腺癌，主要是由于早期(Ⅰ期、Ⅱ期)胰腺癌ctDNA丰度较低，患者血浆中检测到的ctDNA不超过 30%[14]，而CA19-9对比ctDNA在早期胰腺癌检测中更优[15]。因此未来改进液体活检技术将有助于ctDNA在早期胰腺癌的诊断应用。

采用ctDNA的动态监测还能够评估胰腺癌的进展情况，实时做出治疗决策，并提供患者反应的动态视图，也可以尽早区分疾病稳定和疾病进展来进行相应的治疗[16]。同时高水平的ctDNA可能是转移性疾病的一个重要指标[17]，能够为术前提供有价值的信息。因此，基于ctDNA的液体活检能够为进展性胰腺癌提供关于新突变、肿瘤进展和远处转移的多种信息。

2．CTC：肿瘤病变的部分细胞可能会穿透基底膜、基质和血管壁进入体内循环形成CTC。CTC是液体活检的另一个生物标志物，它们的存在表明了肿瘤的恶性转移过程。胰腺癌中的CTC群体高度异质化，可以表达上皮、间充质和干细胞标志物以及细胞外基质(ECM)蛋白，同时在CTC中检测到的突变与原发肿瘤和转移淋巴结的突变也密切相关[18]。虽然胰腺癌能够调控免疫监视来保证肿瘤细胞的生存，但由于细胞自身凋亡、剪切流和免疫细胞攻击，血流中存活的CTC仍然很少[19]。同时血小板也可能通过触发上皮细胞间质转化(EMT)和保护CTC免受剪切力的影响而有助于胰腺癌中CTC的释放和存活[20]。

胰腺癌的CTC液体活检与胰腺癌的诊断具有显著的临床相关性。CTC在早期胰腺癌患者中具有高度敏感性，在Ⅰ期、Ⅱ期胰腺癌患者中其灵敏度高达70%[21]。CTC的存在与预后也密切相关，能够有效预测生存。荟萃分析显示，与CTC阴性患者相比，CTC阳性胰腺癌患者无进展生存期和总生存期更短[22]。CTC还可用于预测胰腺癌的肿瘤复发率，血液中CTC数量更多的患者术后复发时间明显缩短[23]。门静脉血中CTC的丰度也是术后肝转移的重要预测因子[24]。循环血液中CTC的丰度是胰腺癌发展阶段的代表性指标，它在胰腺癌晚期会显著增加[18,23]，因此CTC可用于区分转移性和非转移性疾病，并能提供手术切除成功与否的预测信息[23]。CT扫描结果进一步证实了CTC丰度与肿瘤大小的相关性[25]。CTC还可用于监测胰腺癌患者对化疗和手术的反应和疗效[21]。

3．外泌体：外泌体是所有类型的细胞分泌到细胞外的囊泡，包含可能与胰腺癌生长、侵袭和转移有关的蛋白质组学和基因组学的“运载物”。它们通过携带蛋白质、脂类和核酸，在细胞间的信息传递过程中发挥重要作用[5]。在胰腺癌的肿瘤微环境中，外泌体能够产生化疗耐药性的旁分泌信号[26]，也能帮助癌细胞与其他类型的细胞(包括肿瘤相关成纤维细胞、胰腺星形细胞、β细胞)之间进行信息交换。

肿瘤释放的外泌体还能用于改变生物学功能，如抑制免疫反应、促进脂肪溶解和新发糖尿病，为胰腺癌细胞提供有利的转移前壁龛等。特异性外泌体通过黏附和触发一系列信号通路及炎症反应，与基质细胞和ECM相互作用来控制转移。

通过比较不同胰腺细胞系及其释放的外泌体的mRNA表达的研究证明了不同细胞系和相应外泌体之间具有高度相似性，因此外泌体的分析可以很好地反映其肿瘤细胞来源[27]。外泌体检测有很多优势：样本收集无创或微创，稳定性高，能够携带高分子量较长核酸片段，在癌症的各个阶段都可释放等，这些优势使外泌体分析成为液体活检中不可或缺的标志物，也成为当前测序技术检测全面基因组信息的重要来源[28]。

外泌体膜蛋白GPC1是胰腺癌检测的精确标志物。Melo等[29]通过检测外泌体将早期胰腺癌患者从健康对照组和良性疾病患者中区分出来。同样，Hu等[30]通过外泌体GPC1 mRNA的扩增检测出早期胰腺癌。灵敏度和特异度>90%。肿瘤源性外泌体是目前已知的利用液体活检进行早期胰腺癌检测的最佳标志物之一。GPC1也被证明可以作为胰腺癌的预后标志物，GPC1高表达的患者生存率更低。外泌体还可以反馈肿瘤对手术、化疗或放疗的反应以及胰腺癌的肿瘤负荷状况。肿瘤特异性外泌体数量的增加与远处转移密切有关[29]。外泌体GPC1 mRNA表达是肿瘤分期的精准生物标志物，能够显著区分早期和晚期胰腺癌(P<0.0001)[30]。

三、总结和展望

液体活检是一种很有前途的技术。ctDNA、CTC和外泌体能够在不同体液中释放，为胰腺癌的诊治提供重要信息。各种肿瘤源性成分对胰腺癌的诊断、预后和监测具有不同的应用前景。ctDNA可能是晚期胰腺癌生存预测的较好的生物标志物，但在胰腺癌早期诊断中却不如肿瘤外泌体和CTC更有用。多种生物标志物的联合应用将扩大液体活检的临床应用范围。

随着芯片技术的发展，基于芯片的液体活检也越来越引起人们的关注[31]，这种液体活检具有样品消耗低、精确度高、工作流程简单、灵活性高以及处理时间快和成本低等优势。不断发展的微流体平台可以将整个液体活检的多步骤流程集成到一个芯片中完成。智能手机的不断发展，也可以使微流体、生物传感器或光学传感模式与智能手机相结合，建立一个方便快捷的液体活检的平台，成为胰腺癌诊断、监测和治疗评估的重要工具。未来人工智能的不断发展，液体活检数据的不断丰富，也为临床数据解读提供了更多更准确的帮助。

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