单细胞转录组测序在胰腺领域中的研究进展

毛霄彤 邹文斌 孙畅 廖专

海军军医大学附属长海医院消化内科，上海市胰腺病研究所，上海 200433

【提要】 单细胞转录组测序是采用新一代基因测序技术对细胞群体中每一个细胞的转录组进行高分辨率检测，以揭示生物组织中细胞的异质性。该技术在鉴定特定细胞标志物、发现细胞亚群和稀有细胞以及分析微环境中细胞间关系方面具有独特优势，目前在肿瘤、发育、干细胞、微生物、神经科学等研究领域被广泛应用。

每个细胞都是与众不同的独立个体，很多细胞构成完整的组织，并最终形成功能及表型。常见的多细胞批量测序(bulk RNA-sequencing，bulk RNA-seq)通常对组织样本或细胞群进行测定，容易使细胞间的差异被平均值所掩盖，难以鉴别异质性群体中各个细胞亚群的转录组特征。单细胞转录组测序(single-cell RNA-sequencing，sc RNA-Seq)技术完美解决了这一问题，为研究群体中的不同类型细胞提供了可能。胰腺是一个由复杂细胞组成的器官,在内外分泌功能方面发挥重要作用。近年来胰腺领域开展的单细胞测序研究使人们对胰腺细胞类型、状态和亚群的认识更为深入，并对病理状态下的特定细胞转录组特征进行了精确描述。

一、胰腺的单细胞转录组特征

成熟胰腺可分为内分泌部和外分泌部，其中外分泌部约占胰腺的95%，主要由导管和腺泡细胞组成[1]。内分泌部胰岛由5种内分泌细胞组成，包括α、β、γ、δ和ε细胞，分泌不同的激素。细胞标志物是识别细胞身份的重要工具，sc RNA-Seq对经典的胰腺细胞标志物进行了验证，α、β、γ、δ和ε细胞分别用GCG、INS、PPY、SST、GHRL进行鉴别[2]。同时发现了一些新的候选标志物，如腺泡细胞特异性表达PRSS1、CPA1、CTRB1、REG1B，导管细胞表达KRT19。此外，ACTA2、PDGFRA可作为活化胰腺星状细胞的特异性标志物，RGS5可作为静止胰腺星状细胞的鉴别标志物[3-4]。

sc RNA-Seq数据显示，INS、PPY、SST的表达各占β、γ、δ细胞转录本约50%，而 GCG和GHRL的表达各占α和ε细胞转录本约20%[2]。不同物种的同一类型细胞转录谱存在差异，如α、β细胞中15%的高表达基因存在物种特异性[5]。多个研究报道了人类胰岛中同时表达α和β细胞标志基因的“中间细胞”，但没有排除这是两个细胞的转录组同时被捕获的可能[2,6]。

γ、δ、ε细胞是稀有内分泌细胞，人们对这3类细胞的转录组特征了解有限。Digruccio等[7]发现小鼠δ细胞表达的部分受体与β细胞相一致，而Sstr1和Ghsr的表达仅限于δ细胞。多个研究将瘦素受体鉴定为δ细胞特异性受体[2-3,8-9]，表明δ细胞在调节食物摄入和能量平衡方面发挥重要作用。人类γ细胞除表达TPH1、SERTM1、SPOCK1、ABCC9和SLITRK6外，还表达高水平的转录因子MEIS2、ETV1、ID4和FEV，提示γ细胞与神经元细胞存在相似性[2-3,9-10]。Segerstolpe等[2]发现ε细胞表达NPY1R、OPRK1、PTGER4和ASGR1等特异性受体基因。

二、sc RNA-Seq在胰腺发育领域的研究

为研究胰腺胚胎发育过程中的单个细胞变化特征，研究者对胚胎日(embryonic day，E)12.5、E13.5、E14.5、E16.5和E17.5的小鼠胚胎胰腺及早期人类胎儿胰腺进行了sc RNA-Seq[11-14]。

内分泌祖细胞(endocrine progenitors，EPs)是胚胎胰腺中的一种瞬时细胞类型，能产生5种内分泌细胞，Ngn3的表达是EPs形成的必要条件。Scavuzzo等[12]利用sc RNA-seq技术在E14.5胰腺中鉴定出了4个Ngn3阳性细胞亚群，代表EPs的不同成熟阶段。与E14.5的EPs不同，E16.5的EPs具有更高的β细胞形成倾向。Byrnes等[13]对小鼠胰腺胚胎发育时期的间皮和间质细胞进行了精确分析，发现了一群特征性表达Fev的EPs 。Krentz等[15]对E15.5、E18.5的小鼠胰腺细胞和人类胚胎干细胞(human embryonic stem cells，hESCs)衍生的EPs进行分析，探究了β细胞从hESCs来源的可能性。

为了研究α、β细胞的发育轨迹，Qiu等[16]对小鼠胎儿到成体不同发育阶段的α、β细胞进行了sc RNA-Seq分析。测序结果发现，α细胞和β细胞分别存在448和664个动态调节的基因，表明这两类细胞在成熟过程中使用不同的调节策略。早期β细胞异质性反映了不同的起源、周期阶段和成熟状态，而成体β细胞的转录水平相对均一。Zeng等[17]对不同发育阶段β细胞进行拟时序分析，揭示了增殖期β细胞的转录特征以及调节氨基酸代谢、线粒体呼吸和活性氧产生的相关基因转录水平变化。

三、sc RNA-Seq在糖尿病领域的研究

单细胞研究拓展了β细胞在病理状态下的异常基因表达谱。Baron等[3]发现糖尿病β细胞中内质网应激相关基因表达减少，提示β细胞异质性消失。Wang等[18]确定了3个不同β细胞亚群,其中2个亚群表达细胞增殖相关基因Ki67，其比例在是否患2型糖尿病(type 2 diabetes，T2D)、不同年龄和身体质量指数的人群中存在差异。Segerstolpe等[2]根据RBP4和GPR120鉴定出2个β细胞亚群，其中RBP4促进胰岛素抵抗，GPR120参与诱导胰岛素分泌。

T2D患者和健康人群胰岛的sc RNA-Seq数据提示β细胞在病理状态下存在去分化现象。T2D患者的β细胞表现出幼年内分泌细胞的转录特征，伴随CDKN2B、BARD1、JUNB和PRKD1的表达增加[6]，而INS转录水平相比于健康对照组显著降低[2]。这些发现表明T2D患者的β细胞不能维持完全分化的基因表达谱，继而影响内分泌功能。

sc RNA-Seq研究发现健康人群和T2D患者的胰岛α细胞存在200个差异表达基因，不同研究间差异基因的重叠率为35%[1]。单细胞测序对罕见的增殖性α细胞进行鉴定和转录分析[2,6,16]，Wang等[6]鉴定出高表达Ki67的单个增殖性α细胞，其表现为细胞周期途径的激活和细胞周期检查点控制基因的抑制。

四、sc RNA-Seq在胰腺肿瘤领域的研究

Bernard等[19]对2个低级别胰腺导管内乳头状黏液肿瘤(intraductal papillary mucinous neoplasm，IPMN)、2个高级别IPMN和2个胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)样本进行sc RNA-Seq，通过不同阶段的分析揭示了PDAC逐渐进展的转录组变化。Peng等[4]绘制24个原发性PDAC和11个对照胰腺样本的单细胞转录图谱，发现PDAC内肿瘤细胞具有异质性和调节PDAC进展的关键因素。此外，该研究通过特征性基因表达谱分离出了恶性导管细胞群，并发现具有高度增殖和迁移能力的亚群。

肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts, CAFs)是PDAC进展和耐药性的主要参与者。Elyada等[20]用sc RNA-Seq研究人和小鼠PDAC的肿瘤微环境，证实了肌纤维母细胞样CAF和炎性CAF的存在，并定义了它们独特的基因特征。此外，研究者发现了表达组织相容性复合体MHC Class Ⅱ和CD74的CAF群，将其定义为“抗原呈递CAF”，它们以抗原呈递方式激活CD4+T细胞，从而发挥免疫调节作用。

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