八月瓜的化学组成、抗氧化性及α-葡萄糖苷酶活性抑制研究

罗宗洪，蔡圣宝，易俊洁*

1(昆明理工大学 农业与食品学院，云南 昆明，650500) 2(昆明理工大学 云南省食品安全研究院，云南 昆明，650500)

糖尿病是严重危害人类身体健康的慢性疾病之一，许多临床研究证明氧化应激与糖尿病及其并发症的发生、发展紧密相关[1]。氧化应激的标志物主要为自由基，一般当机体在遭受各种有害刺激时，自由基的产生和抗氧化防御之间严重失衡，从而导致机体组织损伤[2]。目前，通过应用天然抗氧化剂清除自由基，治疗可逆转氧化应激对机体的损伤，从而阻止或延缓糖尿病及其并发症的出现，成为研究者们关注的热点。

α-葡萄糖糖苷酶是位于小肠消化碳水化合物的关键酶，也是引起餐后血糖升高的主要酶之一[2]。有效抑制α-葡萄糖糖苷酶的活性，可以降低餐后血糖，调节糖脂代谢，缓解糖尿病及其并发症的出现[3]。目前,在国内糖尿病药物市场中应用的α-葡萄糖苷酶抑制剂主要为通过生物合成或半生物合成的药物，不仅种类少、副作用大，而且价格昂贵[4]。因此，从天然药食同源植物中提取具有一定活性的小分子化合物，研发既经济又有良好治疗效果的α-葡萄糖苷酶抑制剂具有重要的意义。

八月瓜(Akebiatrifoliata)，俗称“野香蕉”，在中医学中称为预知子，属于三叶木通科木通属木质藤本半常绿缠绕植物，主要分布在云南、贵州、湖南、河南一带，其中以云南昭通、贵州铜仁、湖南张家界、四川雅安居多[5]。农历八月到九月瓜熟开口，果皮呈紫色，种子可榨油。八月瓜营养丰富，富含三萜类皂苷(含有齐墩果酸，熊果酸等)、必需氨基酸(如缬基酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、赖氨酸等)、多糖、维生素C(VC)、甾醇和微量元素等[5-6]。张亚平等[7]报道八月瓜提取物对肝损伤具有一定的保护作用。任红艳等[8]和LU等[9]均发现八月瓜提取物具有显著的抑制肝癌细胞增长的功效，尤其是八月瓜籽。但对八月瓜的植物化学组成、抗氧化性以及对α-糖苷酶活性抑制效果的研究较少。因此，本研究以探究八月瓜活性成分抑制糖尿病为目的，首先通过超高效液相色谱-质谱联用仪定性分析八月瓜果皮和种籽提取物中植物化学组成，并确定其总酚、总黄酮、总皂苷等功能性成分含量，另外，对比果皮和种籽提取物的抗氧化活性和α-糖苷酶活性抑制能力，为八月瓜资源的进一步开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

八月瓜鲜果,云南省昭通市彝良县市场;DPPH、ABTS自由基、芦丁、没食子酸,Sigma-aldrich公司;色谱乙腈和Folin-Ciocalteu,Merck公司。

1.2 仪器与设备

Ultimate 3000超高效液相色谱仪、Q-Exactive Focus轨道离子阱高分辨质谱仪，美国Thermo Fisher Scientific公司；Reprospher 100 C18柱，德国Dr.Maisch公司。

1.3 原料前处理

将购买的新鲜八月瓜在阳光充足的条件下晾晒3～5 d，然后将晒干的八月瓜进行果皮与种籽分离，分别标记装袋。用食品级打粉机将晒干的果皮和种籽分别打成粉末，装袋置于4 ℃冰箱内保存待用。利用石油醚进行脱脂，用80%(体积分数)甲醇抽提。将抽提出的液体部分利用真空泵浓缩，将浓缩的提取物置于冻干机中冻干备用。

1.4 超高效液相色谱质谱联用仪定性分析提取物成分

用高分辨液质联用仪检测八月瓜果皮和种籽的酚类物质组成。采用Reprospher 100 C18柱，以0.1%甲酸水为流动相A，乙腈为流动相B，流动相的体积浓度梯度为：0～5 min,10% B;5～15 min,10%～15% B;15～25 min,15%～35% B;25～30 min,35%～50% B；30～32 min,50%～100% B。进样量为3 μL，流速为0.2 mL/min，柱温设为30 ℃。

ESI-HRMS/MS检测时使用模式为阳离子模式，扫描范围m/z150～2 000。果皮和种籽中酚类化合物的二级谱图信息是由Q-Exactive Orbitrap mass spectrometer检测器检测得到。其余质谱参数设置如下：分辨率70 000；鞘气流速32 L/min；辅助气体流速8 L/min；喷射源电压3.3 kV；S-lens射频水平50%；辅助气体加热器温度350 ℃；毛细管温度320 ℃。

1.5 总酚含量的测定

用福林酚法测定八月瓜果皮和种籽的总酚含量[10-11]。分别取样品4 mg用8 mL 80%(体积分数)甲醇溶解并稀释5倍。然后取0.5 mL样品溶液，加入0.5 mL福林酚试剂。静置1 min。随后加入1.5 mL Na2CO3溶液，用蒸馏水定容至10 mL。混匀，70 ℃水浴中孵育10 min，用酶标仪测定765 nm处的吸光值。总酚的标准曲线以没食子酸为当量，将没食子酸稀释成5个不同浓度，按照以上步骤，测定反应后的吸光值并绘制标准曲线。

1.6 总黄酮含量的测定

总黄酮的含量测定方法参照前人[12-14]研究方法并进行部分改动。分别取样品4 mg溶于8 mL 80%甲醇并用80%甲醇稀释5倍制得样液。取1 mL配制好的样液用70%乙醇定容至2.5 mL，加入0.15 mL 5%(质量分数)的NaNO2溶液，摇匀静置5 min。再加入0.15 mL 10%(质量分数)的Al(NO3)3溶液，摇匀静置6 min，最后加入1 mL 1 mol/L NaOH溶液。混匀，室温下静置3 min，用酶标仪测定500 nm处吸光值。总黄酮的测定用芦丁作为参照物，将芦丁稀释成5个不同浓度，按照以上步骤测定并绘制标准曲线。

1.7 总皂苷含量的含量测定

总皂苷的测量方法参照前人测定三七皂苷的方法[15-16]。以空白试剂做参比，于548 nm处测定吸光度[8]，并绘制标准曲线。

1.8 DPPH抗氧化能力测定

DPPH自由基清除能力测定的方法参考李安林等[17]的方法并稍作修改。首先取0.5 mL八月瓜样品，然后加入2.0 mL的DPPH(0.1 mmol/L)试剂后，暗处放置30 min，然后在517 nm波长下测定反应液的吸光值A1。同时，用0.5 mL甲醇替代样品加入到2.0 mL DPPH 试剂中，于相同条件下测定其吸光值A2。实验标准品选用VC做对照试验，按照以上步骤进行实验。八月瓜提取物对DPPH自由的清除能力按公式(1)计算：

(1)

1.9 ABTS自由基抗氧化能力测定

八月瓜ABTS自由基抗氧化能力测定方法参照文献并稍作修改。ABTS自由基工作液配制：取7 mmol/L ABTS 5 mL加入 88 μL 40 mmol/L 的过硫化钾溶液，混匀后，室温避光放置12～16 h，形成ABTS自由基储备液。使用时用乙醇稀释，于734 nm处测定吸光值，工作液的吸光值应为(0.7±0.02)。样品前处理同 DPPH 相同，0.3 mL样品，加入ABTS工作液2.7 mL：对照组为 0.3 mL甲醇和 ABTS工作液2.7 mL，混匀。在多功能酶标板上于734 nm处测定吸光值。样品组和对照组均设立空白对照。选用VC做标准品对照试验，按照样品提取物的实验方法进行试验。

1.10 α-葡萄糖苷酶的活性抑制测定

α-葡萄糖苷酶的活性抑制测定方法参照张丽等[19]的方法。八月瓜提取物对α-糖苷酶的活性抑制能力采用公式(2)计算，并用Origin软件求出IC50值。

(2)

1.11 数据统计分析

实验所有数据以平均值±标准误差表示，每组实验进行3次平行。采用Tukey单因素方差分析(P<0.05)，均用Origin 8.5进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 八月瓜提取物组分质谱定性分析

采用高分辨液相质谱联用技术对八月瓜果皮和种籽提取物的组分进行定性分析。从图1可看出，八月瓜果皮和种籽提取物的成分相似，出峰时间大致相同，但果皮提取物的峰高和峰面积总体低于种籽提取物，说明种籽的功能性成分高于果皮。表1列出了八月瓜果皮和种籽提取物的主要活性成分，其中酚类物质有绿原酸和2,2’-亚甲基双-(6-叔丁基-4-甲基苯酚)，皂苷类物质有斛皮素-3-葡萄糖苷、羽扇豆异黄酮-O-葡萄糖苷、常春藤皂苷D、甾体皂苷F、常春藤皂苷C、常春藤皂甙元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-α-L-阿拉伯吡喃糖甙。从峰面积比可看出，这些组分中斛皮素-3-葡萄糖苷在果皮中含量较高，而甾体皂苷F、常春藤皂苷C、2,2’-亚甲基双-(6-叔丁基-4-甲基苯酚)在种籽中含量更高，其余成分在果皮和种籽中含量无显著差异。

2.2 八月瓜提取物总酚、总黄酮、总皂苷含量

八月瓜果皮和种籽提取物中总酚、黄酮、总皂苷含量如表2所示。

注：序号按出峰时间排列，与图1中标注序号对应。

注：结果是以原料(果皮或种籽)干重计，并且数值均带有SD值。表中同一列不同字母表示显著差异(P<0.05)。

实验结果表明，八月瓜的总酚、总黄酮、总皂苷含量丰富。潘冬梅等[13]对8种药食同源原料的总酚和总黄酮含量进行了研究，发现酚含量较高的为甘草、决明子、菊花(>20 mg/g)，较低的为栀子、罗汉果、酸枣仁、郁李仁、莱菔子；总黄酮含量较高的为决明子、菊花、栀子(>24 mg/g)，较低的为甘草、酸枣仁、郁李仁、罗汉果、莱菔子。与此相比，本实验八月瓜中的总酚、总黄酮含量均显著高于其他药食同源植物。查阅部分文献[14]中关于八月瓜的研究结果，云顶地区的八月瓜总黄酮含量为3.81%，大定地区的含量为2.16%。云雾、都匀、王司等地区分别为2.05%、1.89%、2.86%。发现本实验所测得的总酚、总黄酮含量都更高，可能是由于地区和季节性差异。八月瓜的总皂苷含量丰富，朱金段等[24]对预知子常春藤皂苷元的含量测量中得出，预知子中常春藤皂苷元的含量在0.10～28.53 mg/g，与本研究所测的总皂苷含量对比可知，八月瓜总皂苷中常春藤皂苷含量较高。从表2中还可看出，八月瓜的种籽中的总酚、总黄酮、总皂苷含量均显著高于果皮，尤其是总酚含量，八月瓜种籽的总酚含量比果皮含量高出约50 mg/g。

2.3 八月瓜提取物DPPH自由基消除能力

八月瓜提取物的DPPH抗氧化活性如图2所示。2种提取物都具有清除DPPH自由基的能力，且2种提取物对DPPH自由基的清除能力与其浓度存在明显的剂量-效应关系。根据潘冬梅等[13]对8种药食同源原料的DPPH抗氧化活性的研究发现，在10 mg/mL质量浓度下，甘草、决明子的DPPH自由基的清除率低于80%，罗汉果、莱菔子、酸枣仁、郁李仁等的DPPH自由基的清除率低于50%。而八月瓜果皮提取物DPPH自由基清除能力的IC50值为53.56 μg/mL，种籽提取物的IC50值为47.24 μg/mL。对比可以看出，八月瓜的DPPH自由基的清除能力显著高于其他药食同源植物。在不同浓度下，八月瓜种籽提取物的DPPH自由基的清除能力均显著大于果皮提取物。DPPH自由基清除能力可能与总酚、总黄酮含量有关[17]，由此推测，八月瓜种籽提取物表现出较高的清除DPPH自由基的能力主要是因为其总酚和总黄酮含量较高。

2.4 八月瓜提取物ABTS自由基清除能力

图3为八月瓜提取物ABTS自由基清除能力。从图3中可以看出，2种提取物均具有清除ABTS自由基的能力，并且可以明显观察到随着提取物浓度的增加，其对ABTS自由基的清除能力逐渐增强，说明2种提取物的浓度对ABTS自由基的清除能力存在明显的剂量-效应关系。白海娜等人[25]研究白藜芦醇与黑木耳多糖对ABTS自由基清除的协同作用，得到白藜芦醇和黑木耳多糖的IC50值分别为3.56和61.46 mg/L。李培源等[26]对鸡眼草、白藜芦醇与黑木耳多糖等对ABTS自由基的清除能力的研究发现鸡眼草提取物在0.5 mg/mL时，ABTS自由基清除率最高的为鸡眼草乙酸乙酯提取物，清除率为77.5%。八月瓜果皮提取物ABTS自由基清除率的IC50值为42.25 μg/mL，种籽提取物的IC50值为48.99 μg/mL，与文献[25-26]结果对比发现，本文中八月瓜提取物对ABTS自由基的清除能力与黑木耳多糖相近，远高于鸡眼草和白藜芦醇，说明八月瓜提取物抗氧化能力显著。由图1和表1可看出，八月瓜提取物中富含绿原酸，八月瓜提取物的ABTS自由基抗氧化活性可能与其绿原酸含量有关系，使其具有较高的ABTS自由基抗氧化活性[27]。另外，八月瓜果皮提取物ABTS自由基清除率的IC50值为42.25 μg/mL，种籽提取物的IC50值为48.99 μg/mL，可以看出，八月瓜种籽提取物的ABTS自由基清除能力显著高于果皮提取物。

2.5 八月瓜提取物对α-葡萄糖苷酶活性抑制能力

从图4可以看出，八月瓜果皮提取物和种籽提取物都具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的能力，提取物对α-葡萄糖苷酶的活性抑制能力具有剂量效应。与果皮提取物相比，八月瓜种籽提取物的抑制效果更高。

高小平等[28]对126种经水煮醇沉提取的常用中药进行α-葡萄糖苷酶抑制活性筛选研究，其研究结果表明，在0.28 mg/mL反应体系下，24种中药提取物显著抑制α-葡萄糖苷酶活性，其中大黄、山茱萸、青果、地瑜、桑白皮等中药提取物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率超过90%，虎杖、丹参、知母等中药提取物抑制率在50%左右，而八月瓜果皮提取物对α-葡萄糖苷酶的活性抑制率IC50值为14.15 μg/mL，种籽提取物对α-葡萄糖苷酶的活性抑制率IC50值为15.54 μg/mL，说明八月瓜具有非常显著的α-葡萄糖苷酶抑制能力。由于α-葡萄糖苷酶活性与糖尿病的发生密切相关，本实验结果可以从侧面反映八月瓜提取物可能对抑制或减缓糖尿病及其并发症的出现具有积极的作用。

3 结论

本实验研究了八月瓜果皮和种籽的化合物组成、总酚、总黄酮、总皂苷含量、抗氧化活性以及糖苷酶活性抑制能力。八月瓜果皮和种籽提取物中检出9种化合物，多种为甾体皂苷和常春藤皂苷类化合物。八月瓜中富含多酚、黄酮和皂苷类物质，而且种籽中的含量高于果皮。另外，八月瓜种籽提取物和果皮提取物的DPPH和ABTS自由基清除能力都比较突出，且具有明显的剂量效应，说明八月瓜具有良好的抗氧化活性。同时，本研究还测得其对α-葡萄糖苷酶的活性抑制效果良好，且八月瓜种籽提取物的抑制效果显著优于果皮提取物。本实验结果为八月瓜相关功能性产品开发提供了研究基础。在此基础上，可以进一步探究八月瓜具体活性成分对糖尿病及其并发症抑制效果机制研究。