NaOH预处理对甘蔗渣成分和酶解效率的影响

刘 洋，胡小文，姚艳丽

(1中国热带农业科学院湛江实验站，广东湛江524013；2广东省旱作节水农业工程技术研究中心，广东湛江524013)

0 引言

随着不可再生能源如石油、天然气、煤炭等的日益枯竭，寻找新的可再生能源将是未来能源化利用的重要方向[1]。可再生能源主要包括太阳能、风力、潮汐能、地热能、生物质能等[2]。地球上存在着大量的生物质资源，就木质纤维素来说，全球每年由光合作用产生的木质纤维原料高达4500亿t[3]，如果将这些生物质资源转化成燃料乙醇，不仅可以解决部分能源短缺问题，还可以减少污染。目前可供利用的生物质资源主要是作物秸秆，包括玉米、小麦、水稻等秸秆，但是其在收集和搬运过程中耗费成本较高，就目前技术而言还未形成真正的产业化生产。甘蔗是中国最大的制糖原料，南方蔗区甘蔗总产量7000多万t，每年产生的甘蔗渣产量约为2000多万t[4]。甘蔗渣是甘蔗榨糖后的产物，利用其生产燃料乙醇不仅可以实现废弃物的再利用，更极大地避免了因直接燃烧而带来的环境污染问题，同时甘蔗渣收集简单，成本较低，因此利用甘蔗渣生产燃料乙醇具有广阔的发展前景[5]。

和其他生物质原料一样，甘蔗渣成分主要包括木质素、纤维素、半纤维素、灰分等，由于甘蔗渣原料的组成及结构特点，木质素和纤维素、半纤维素缠绕在一起形成晶体结构，阻碍了纤维素酶与底物的接触，大大降低了酶解效果[6]，因此必须采取预处理手段才能打破原有的晶体结构提高其酶解能力。现有的预处理技术主要有物理法、化学法、生物法等[7]，其中碱处理可以在低温条件下进行，不仅纤维素和半纤维素损失少，而且无抑制产物形成，受到了广泛关注[8]。在碱性环境下，半纤维素及木质素分子间的酯键发生皂化，酯键的断裂引起木质素溶解，同时纤维素、半纤维素和木质素间的孔隙增大，造成纤维素溶胀和结晶度降低等[9]，因此NaOH可以有效地去除木质素，使纤维素润胀，有利于提高酶解效率[10]。前人的研究发现，预处理温度、NaOH质量分数及预处理时间对酶解和发酵效率影响较为显著，经过NaOH预处理后的甘蔗渣比表面积显著增加，木质素显著降低[11]。在低浓度的NaOH溶液范围内，甘蔗渣的结晶度值升高，当NaOH溶液浓度再升高时，甘蔗渣纤维素的结晶度值下降[12]。研究还发现，NaOH预处理可以有效提高甘蔗渣的酶解效率，促进低聚木糖的生产[13]。虽然前人在NaOH预处理甘蔗渣做了一些研究，但是仍有一些问题需要进一步研究和改进。一是在不同的NaOH浓度、温度、处理时间和固液比条件下，甘蔗渣成分和物理结构如何变化；二是预处理条件是否可以更加优化。针对这2个问题，本文在前人研究的基础上，系统分析不同NaOH预处理条件对甘蔗渣成分、固体得率、物理结构和酶解效率的影响，期望能为今后开展甘蔗渣乙醇生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

甘蔗渣来自湛江大华甘蔗制糖企业，在中国热带农业科学院湛江实验站实验室保存。

1.2 实验试剂

纤维素酶购买自Solarbio公司，柠檬酸、柠檬酸钠、3, 5-二硝基水杨酸、酒石酸钾钠、氢氧化钠、苯酚和无水亚硫酸氢钾购买自上海麦克林公司，所用试剂均为分析纯。

1.3 实验仪器

FW100泰斯特粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；LDZX-75KBS申安高压灭菌锅，上海申安医疗器械厂；723PCS凤凰紫外可见分光光度计，上海凤凰光学科仪有限公司；SHZ-DIII予华牌循环水真空泵，巩义市予华仪器有限责任公司；DHG-9123A鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；HH-6金坛华立恒温水浴锅，金坛市华立实验仪器厂；RU-T-15超纯水系统，上海同田仪器有限公司；THZ-82国立恒温气浴摇床，常州市国立试验设备研究所；JA3003N电子天秤，上海菁海仪器有限公司；DS3200普洛帝超声波振荡器，陕西普洛帝测控技术有限公司；JY100乔跃雪花制冰机，上海乔跃电子有限公司；H1850R湘仪冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；S-3700N扫描电子显微镜，日本HITACHI公司。

1.4 试验方法

1.4.1 NaOH浓度的实验方法

在100 mL三角瓶中加入粒径0.425～0.850 mm的甘蔗渣粉末2.0 g，然后按1︰10(g/mL)的固液比分别加入浓度为7%、9%、10%、11%、13%的NaOH溶液，使固体和液体充分混匀后在水浴锅内50℃下反应30 min，冷却，用蒸馏水洗涤至中性，抽滤，备用。

1.4.2 处理温度的实验方法

在100 mL三角瓶中加入粒径0.425～0.850 mm的甘蔗渣粉末2.0 g，然后按1︰10(g/mL)的固液比分别加入浓度为9%的NaOH溶液，使固体和液体充分混匀后分别在水浴锅内30、40、50、60、70℃下反应30 min，冷却，用蒸馏水洗涤至中性，抽滤，备用。

1.4.3 固液比的实验方法

在100 mL三角瓶中加入粒径0.425～0.850 mm的甘蔗渣粉末2.0 g，然后按固液比1︰8、1︰10、1︰12、1︰14、1︰16(g/mL)分别加入浓度为 9%的NaOH溶液，使固体和液体充分混匀后在水浴锅内50℃下反应30 min，冷却，用蒸馏水洗涤至中性，抽滤，备用。

1.4.4 处理时间的实验方法

在100 mL三角瓶中加入粒径0.425～0.850 mm的甘蔗渣粉末2.0 g，然后按1︰10(g/mL)的固液比分别加入浓度为9%的NaOH溶液，使固体和液体充分混匀后在水浴锅内50℃下分别反应10、20、30、40、50 min，冷却，用蒸馏水洗涤至中性，抽滤，备用。

1.4.5 甘蔗渣成分的测定

甘蔗渣成分分析甘蔗渣中半纤维素、纤维素和木质素含量测定参考国际生物能源中心提供的方法《Determination of Structural Carbohydrates and Lignin in Biomass》[14]，木质素的测定参考国标GB/T 747-2003[15]。

1.4.6 固体得率的测定

试样经NaOH处理后固体部分用蒸馏水冲洗至中性，用G3号砂芯漏斗抽滤，于105℃烘箱烘至恒重，计算其固体得率。

固体得率(%)=(处理后样品重/处理前样品重)×100%。

1.4.7 扫描电镜实验方法

对处理前后的甘蔗渣样品进行镀金处理，然后利用扫描电子显微镜观察样品的物理表面特征和内部结构特征，选择聚焦距离为10 μm和50 μm拍照记录并保存。

1.4.8 纤维素酶液的制备

称取商品干粉纤维素酶(3 units/mg)1.650 g，用柠檬酸缓冲溶液配制100 mL酶液。配制柠檬酸钠缓冲液0.05 mol/L pH 4.8，所用的柠檬酸、柠檬酸钠试剂均为分析纯。配制方法如下：首先分别配制A、B液，然后按一定比例混合。A液(柠檬酸溶液 0.1 mol/L)：精确称取C6H8O7(MW=210.14)试剂21.014 g置于250 mL烧杯中，加入适量蒸馏水搅拌溶解，转移至1000 mL容量瓶并多次漂洗，用蒸馏水定容后混匀，放入4℃冰箱保存备用。B液(柠檬酸钠溶液0.1 mol/L)：精确称取 Na3C6H5O7·2H2O(MW=294.12)试剂29.412 g置于250 mL烧杯中，加入适量蒸馏水搅拌溶解，转移至1000 mL容量瓶并多次漂洗，用蒸馏水定容后混匀，同样放入4℃冰箱中保存备用。量取A液27.12 mL和B液22.88 mL使其充分混合，移入 100 mL容量瓶定容至刻度，充分混匀，得到0.05 mol/L pH 4.8的柠檬酸缓冲液，于4℃冰箱中保存，用于测定滤纸酶活。

1.4.9 酶活性测定

酶解反应在100 mL三角瓶中进行，取预处理后绝干重为1 g的甘蔗渣作为酶解底物，以固液比1︰16，加入 pH为 4.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，纤维素酶用量为20 FPU/g(绝干底物)，在50℃，100 r/min的恒温振荡器中反应48 h。酶解完成后，沸水浴10 min终止酶解反应，冰水冷却，于12000 r/min离心5 min，取上清液稀释适当倍数测还原糖和糠醛含量，过滤并洗涤酶解固体，风干后保存于密封袋，用于后续检测。测定纤维素酶酶活以FPU/mL表示，定义为：在 50℃条件下 60 min内分解滤纸产生 1 μmol葡萄糖为1个活力单位。酶活测定依照美国可再生能源实验室出版的方法《Measurement of Cellulase Activities》[16]。β-葡萄糖苷酶酶活单位(U/mL)定义为：在测定条件(pH值5.0，50℃±2℃)下，每分钟水解底物产生1 μmol对硝基苯酚所需的酶量为1个酶活单位。酶活测定方法参考韦斌如建立的 pNPG比色法[17]。还原糖浓度测定采用 DNS法(3, 5-二硝基水杨酸法)[18]。

2 结果与分析

2.1 不同碱处理对甘蔗渣主要成分的影响

图1实验结果表明，不同碱浓度对半纤维素和纤维素影响较大，随着碱浓度的增加，半纤维素和纤维素含量逐渐降低，在碱浓度为7%时，半纤维素含量和纤维素含量均最高，分别为 16.85%和45.63%；在碱浓度为13%时，半纤维素含量和纤维素含量均最低，分别为9.87%和37.56%。木质素含量也随着碱浓度的增大而逐渐降低，但变化相对较小，变化范围为15.23%～17.85%(图1)。

不同处理温度对半纤维素影响最大，当温度上升到50℃以上时，半纤维素含量迅速下降，在温度为70℃时，半纤维素含量最低，为8.25%。纤维素含量随着温度的上升呈现逐渐下降的趋势，在温度为70℃时，纤维素含量最低，为35.65%。木质素含量虽然随着温度的升高呈现一定的下降趋势，但变化不是十分明显，变化范围15.98%～18.55%(图2)。

图1 不同碱浓度对甘蔗渣成分的影响

图2 不同碱处理温度对甘蔗渣成分的影响

相比碱浓度和温度，固液比对甘蔗渣主要成分的影响趋势有所不同。无论是半纤维素、纤维素还是木质素含量都呈现先下降后升高的趋势。在固液比为1︰12时，半纤维素含量最低，为10.56%，在固液比为1︰14时，纤维素和木质素含量最低，分别为40.33%和15.63%。在固液比为1︰8时，半纤维素含量、纤维素含量和木质素含量均最高，分别为 16.35%、45.83%和 17.55%(图 3)。

图3 不同碱处理固液比对甘蔗渣成分的影响

随着处理时间的增加，纤维素含量和木质素含量均呈现逐渐下降的趋势，处理时间从10 min到50 min，纤维素含量由46.12%下降到38.25%，木质素含量由18.24%下降到15.23%。半纤维素含量在处理40 min后达到最低为10.03%(图4)。

图4 不同碱处理时间对甘蔗渣成分的影响

利用NaOH预处理甘蔗渣，不同的处理条件对甘蔗渣成分均存在一定程度的影响。随着NaOH浓 度、温度和处理时间的增加，半纤维素、纤维素和木质素含量总体呈现逐渐降低的趋势，这是因为，用NaOH处理甘蔗渣可以破坏细胞壁溶解半纤维素和木质素通过水解成为糖醛酸和乙酸酯，降低纤维素的结晶度。NaOH浓度和处理温度越高，处理时间越长，甘蔗渣物理结构破坏越严重，通过该方法，可以将甘蔗渣简单地分馏成碱溶性木质素、半纤维素和残留物，利用它们获得更有价值的产品。甘蔗渣经过NaOH预处理可以消化木质素，并使纤维素和半纤维素用于水解[19]。研究发现用1%和3%NaOH溶液连续处理甘蔗渣，可从蔗渣中得到 25.1%半纤维素，占原始半纤维素的74.9%[20]。本研究还发现，不同固液比对甘蔗渣成分影响较小，表明固液比不是NaOH预处理甘蔗渣的关键因素。

2.2 不同碱处理对甘蔗渣固体得率的影响

不同碱浓度对甘蔗渣固体得率有一定影响，但变化不明显，碱浓度处理固体得率在 53.2%～61.12%之间，10%左右的碱浓度固体得率最低图5)。不同温度对甘蔗渣固体得率影响较大，在30℃时，甘蔗渣固体得率最高为98.25%，在50℃时，甘蔗渣固体得率最低为54.2%(图6)。而不同固液比和处理时间对甘蔗渣固体得率几乎没有影响(图7和图8)。

本研究发现，处理温度为50℃时，固体得率最低，而过低或者过高的温度都会使固体得率升高。这是由于温度过低时，不利于化学反应的进行，固体降解速率较低。但是温度过高会降低NaOH对半纤维素和纤维素的化学作用，从而保持一个较高的固体得率水平。

2.3 不同碱处理对甘蔗渣物理结构的影响

图5 不同碱浓度对甘蔗渣预处理固体得率的影响

图6 不同碱处理温度对甘蔗渣预处理固体得率的影响

图7 不同碱处理固液比对甘蔗渣预处理固体得率的影响

图8 不同碱处理时间对甘蔗渣预处理固体得率的影响

对不同碱处理后的甘蔗渣物理结构进行电镜照相，结果表明：不同碱浓度、温度、固液比和处理时间对甘蔗渣物理结构都有不同程度的影响。从结果可以看到对照样品蔗渣原料结构完整紧密，纤维素束排列有序，原料表面光滑、平整，几乎看不到内部形态(图9)。而用浓度10%或13%的NaOH处理后，可清晰观察到蔗渣结构受到破坏，内部结构变得疏松多孔，表面剥离出纤维碎片，多处出现小孔(图 10)。70℃处理甘蔗渣后可以观察到，甘蔗渣表面出现多个孔洞，甚至出现较大的缝隙，木质素和纤维素结构已基本破坏。不同固液比对甘蔗渣处理后甘蔗渣表面出现一定程度的破坏，但效果不明显，大部分结构还保持原状(图 11)。处理时间对甘蔗渣影响较大，处理30 min后甘蔗渣表面开始出现小孔，进一步处理后蔗渣表面变得更加崎岖、凹凸不平，纤维出现部分剥离，表面小孔变多变密(图12)。

使用NaOH预处理甘蔗渣后，甘蔗渣的物理结构破坏比较严重，综合来看，NaOH浓度、处理时间和温度对物理结构影响较大。这是因为甘蔗渣半纤维素在纤维细胞壁的分布以次生壁外层浓度最大，而且半纤维素以粘合剂方式存在于细胞壁各薄层间，因而半纤维素脱除后，会使纤维细胞壁严重分层。使得原料表面变得粗糙，组分溶出而出现小孔[21]。进一步酶解后，蔗渣表面变得更加崎岖、凹凸不平，纤维出现部分剥离，表面小孔变多变密。可以观察到，酶解后的原料残渣的结构仍较完整，这是由于酶解后的蔗渣仍含有较多未被水解的纤维素，它们仍被木质素紧密连接在一起。

图9 不同碱浓度对甘蔗渣物理结构的影响

图10 不同碱处理温度对甘蔗物理结构的影响

图11 不同碱处理固液比对甘蔗渣物理结构的影响

图12 不同碱处理时间对甘蔗渣物理结构的影响

图13 不同碱浓度对甘蔗渣酶解效率的影响

2.4 不同碱处理对酶解效率的影响

利用不同预处理条件下的 NaOH预处理甘蔗渣，实验结果如下：随着NaOH浓度的增加，酶与纤维素内部及表面积逐渐增加，从而使还原糖质量分数逐渐增加；当NaOH浓度增加到10%后，随着浓度的继续增加，还原糖质量分数略有下降(图13)。所以选择碱浓度为 10%。随着温度的升高，木质素越易脱除，还原糖含量不断地增加；当温度上升至50℃以后，还原糖含量下降(图 14)。因此，选择温度为50℃。随着固液比的增加，还原糖质量分数变化不明显，当固液比为1︰16时，略有升高，这是因为当固液比低于1︰8时，木质素不易被脱除，当增加到一定程度后，还原糖质量分数与固液比达到一个平衡点，所以最佳固液比为 1︰16(图 15)。如果处理时间太短，NaOH不能完全脱除木质素，影响水解效率；如果处理时间过长，会使纤维素部分溶解而减少处理液中的糖含量。考虑到糖产量和节约时间，选择处理时间为30 min左右(图16)。

和甘蔗渣成分相比较，酶解过程更为复杂，过高的NaOH浓度、预处理温度和时间都会阻碍酶解的进行。随着浓度增加，有效碱对碳水化合物的损害作用增加，多余的NaOH会使纤维素遭到破坏。当温度上升至50℃以后，还原糖含量下降，这是因为当温度升高到一定值时，部分还原糖容易发生分解反应，生成糠醛等副产物，使还原糖含量降低，还原糖质量分数略有下降。经过不同处理对甘蔗渣处理的结果，得出最佳的处理条件为：NaOH浓度10%，温度50℃，固液比1︰16，处理时间30 min。在这个条件下，甘蔗渣降解成还原糖的效率最高，还原糖浓度大约在16%左右。

图14 不同温度对甘蔗渣酶解效率的影响

图15 不同固液比对甘蔗渣酶解效率的影响

图16 不同处理时间对甘蔗渣酶解效率的影响

3 结论

本文利用NaOH预处理甘蔗渣，通过不同浓度、温度、固液比和处理时间对甘蔗渣成分含量、固体得率、物理结构和酶解效率进行了研究。结果表明：NaOH浓度、预处理温度和预处理时间是影响甘蔗渣成分的关键因素。处理温度对固体得率影响较大，而浓度、固液比和处理时间的影响不明显。不同碱浓度、温度、固液比和处理时间对甘蔗渣物理结构都有不同程度的影响，处理后的甘蔗渣物理结构受到破坏，内部结构变得疏松多孔。根据酶解效率实验得出的最佳预处理条件为：浓度10%、温度50℃、固液比1︰16、处理时间30 min，其预处理甘蔗渣产物还原糖浓度在16%左右。