小鼠局部淋巴结实验在红花注射液致敏性研究中的应用

徐小玲，邬姗，潘望平，吕晓君，吴森，何开勇

(湖北省药品监督检验研究院，武汉 430064)

随着中药注射剂在临床的广泛应用，与其相关的变态反应的报道也日益增多。红花注射液是由中药红花经提取制成的灭菌溶液，主要成分大多为相对分子质量较小的化合物，主要含有色素、黄酮类化合物、酚酸、脂肪酸、挥发油及多炔等[1-2]，临床上用于闭塞性脑血管、冠心病和脉管炎等疾病的治疗。近年来，红花注射液在临床使用中引起的不良反应特别是变态反应日趋增多[3]，已逐渐引起人们的重视。目前国内对药物的致敏性评价主要通过主动过敏实验、被动过敏实验，以及应用于Ⅵ型超敏反应的豚鼠最大化实验(guinea-pig maximization test，GPMT)和局部封闭涂皮实验(buehler test，BT)[4-5]，而该类实验主要针对的是大分子蛋白质类引起的变态反应，对小分子化合物容易出现假阴性结果。对于小分子化学药物，尤其是变态反应居高不下的中药注射剂，亟需要建立一种灵敏、特异、简便和可靠的非临床安全性实验方法来评价其致敏潜在风险。局部淋巴结实验(local lymph node assay，LLNA)是目前惟一可靠的筛选和评价药物超敏反应的实验方法，主要依据是腘窝淋巴结(popliteal lymph node，PLN)是足趾部注射外源化学物质发生免疫应答的第一部位和惟一引流淋巴结，因此，在足趾引入的致敏物质势必首先导致腘窝淋巴结及其相关免疫细胞的变化[6-9]。本研究旨在建立小鼠LLNA的方法，以替代传统的豚鼠全身主动过敏实验(active systemic anaphylaxis，ASA)检测方法，对中药红花注射液的致敏性进行检测，探讨红花注射液引起变态反应的可能机制，并与豚鼠全身主动过敏实验进行比较。

1 材料与方法

1.1试药 供试品1～5：红花注射液(批号：150411301，14091912，140914，141002020，10314122-32)；阴性对照：磷酸盐缓冲液(PBS，pH值7.2)，氯化钠注射液；阳性对照：链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)、2，4，6-三硝基苯磺酸(2，4，6-trinitrobenzene-sulfonic acid sol，TNBS)、D-青霉胺(D-penicillamine，D-PEN)。anti-mouse B220抗体、anti-mouse CD3抗体、anti-mouse CD4抗体、anti-mouse CD8抗体、anti-mouse CD69抗体(美国eBioscience公司和BD公司)。

1.2实验动物 无特定病原体(SPF)级Balb/c小鼠，雌性，6～8周龄，体质量18～22 g，由武汉生物制品研究所有限责任公司提供，动物生产许可证号：SCXK(鄂) 2017-0013。小鼠适应性饲养l周后开始实验。自由饮水摄食，温度(23±1) ℃，相对湿度45%～55%，12 h明暗交替。豚鼠，健康合格，体质量250～350 g，雌雄各半，由武汉生物制品研究所有限责任公司提供，动物生产许可证号：SCXK(鄂) 2017-0013，适应性喂养l周后开始实验。动物使用许可证号：SYXK(鄂) 2014-0009。

1.3仪器 Navios流式细胞仪(贝克曼库尔特商贸有限公司)；TC20细胞计数仪(美国BIO-RAD公司)；高速冷冻离心机(贝克曼库尔特公司)。

1.4豚鼠全身主动变态反应 按《中华人民共和国药典》2015年版四部进行。豚鼠随机分为6组，每组6只。第1组为氯化钠注射液对照组，第2～6组为供试品1～5。各组动物分别腹腔注射氯化钠注射液和供试品溶液0.5 mL，隔日致敏1次，共3次。在注射后第14，21 天，分别从耳静脉注射氯化钠注射液和供试品溶液1 mL，观察激发后30 min内豚鼠的反应。

1.5小鼠局部淋巴结实验

1.5.1剂量与分组 实验设9个组别，随机分为阴性对照组(PBS)、STZ组、TNBS组、D-PEN组、供试品组1～5，每组10只小鼠。将STZ溶于PBS。

1.5.2免疫动物 固定小鼠，以乙醇棉球消毒左后侧(处理侧)足趾部，一次性无菌胰岛素注射器皮下注射给药，进针方向由足跟指向足尖，各组给药体积均为50 μL，对照组给予PBS，对侧不做处理。

1.5.3PLN质量指数和PLN细胞指数测定 注射7 d后，处死小鼠，将其双侧腘窝淋巴结与周围组织分离取出，分别用分析天平称质量。计算 PLN质量指数(WI)，PLN质量指数=左侧PLN质量/右侧PLN质量。

PLN细胞指数测定，分别取小鼠双侧腘窝淋巴结，用载玻片压碎，加入PBS溶液(pH 值7.4)2 mL，制成单细胞悬液，用细胞计数仪计数。计算PLN细胞指数(CI)，PLN细胞指数=左侧PLN细胞数/右侧PLN细胞数。

1.5.4淋巴细胞及早期活化指标分析 用解剖镊分离、摘取腘窝淋巴结(PLN)，常规制备单细胞悬液。用冷PBS洗涤细胞2次，细胞计数仪计数，调整细胞浓度为1×107·L-1。取上述各组淋巴细胞悬液100 μL(1×106个细胞)于流式管中，加入相应抗小鼠抗体0.5 μg，混匀后，室温避光孵育30 min。然后经PBS洗涤2次(1400 r·min-1，r=18.5 cm，5 min)，弃上清液，加 PBS溶液0.4 mL重悬，过滤后流式细胞仪分析。

2 结果

2.1豚鼠全身主动变态反应 结果显示，供试品1～5组和氯化钠注射液组均未出现明显变态反应症状。

2.2小鼠局部淋巴结实验

2.2.1PLN质量指数和PLN细胞指数测定 由表1可见，单次足趾部给予受试物后第7天，阳性对照组和供试品组2的PLN质量指数与阴性对照组比较有所升高，但差异无统计学意义；阳性对照组和供试品组1～5的PLN细胞指数与阴性对照组比较，均有升高，但差异无统计学意义，即WI和CI未达到阳性标准。

表1 受试物对PLN质量指数和细胞指数的影响

组别PLN质量指数PLN细胞指数阴性对照组1.08±0.281.74±0.83TNBS组1.34±0.802.49±3.29STZ组1.99±0.945.23±4.36D-PEN组1.32±0.413.25±3.52供试品1组1.15±0.301.93±0.91供试品2组1.35±0.491.95±0.73供试品3组1.04±0.452.12±0.80供试品4组0.97±0.311.92±0.81供试品5组0.93±0.402.06±0.87

3 讨论

中药注射剂临床应用广泛，但近年来不良反应频发，其中变态反应占75%，中药注射剂中的某些成分、制剂辅料以及体内代谢产物可能为致敏原，引起I型超敏反应[10-12]。目前，大多数过敏实验方法如ASA都是根据I型变态反应发病机制的设计建立的。本研究采用ASA法检查5批中药注射剂，结果均未出现明显变态反应。但是，ASA的缺点是要采用较多动物，需要激发后进行观察，主观性较强，且给动物带来了痛苦，不符合“3R原则”。

图1 T、B细胞比例及其早期活化分子的流式分析图

表2 阳性对照对T、B细胞比例及早期活化分子的影响

组别CD3CD3CD4CD3CD8B220CD3CD69CD4CD69CD8CD69B220CD69阴性对照组85.60±5.5047.30±4.1035.00±3.2016.60±4.102.13±0.302.68±0.460.02±0.040.11±0.07TNBS组80.20±11.5049.50±7.6027.90±6.40①21.90±12.002.83±0.82①3.20±0.830.02±0.020.15±0.04STZ组87.10±6.9048.40±3.5037.20±6.4015.20±6.501.58±0.491.81±0.43②0.02±0.020.05±0.04D-PEN组80.90±4.7043.80±4.7033.90±1.9019.50±5.001.44±0.24①2.00±0.280.03±0.040.16±0.07

①与阴性对照组比较，P<0.05；②与阴性对照组比较，P<0.01。

①Compared with negative control group,P<0.05；②Compared with negative control group，P<0.01.

表3 红花注射液对T、B细胞比例及早期活化分子的影响

组别CD3CD3CD4CD3CD8B220CD3CD69CD4CD69CD8CD69B220CD69阴性对照组85.30±10.3055.20±8.3029.50±7.2014.30±2.602.33±0.402.79±0.470.02±0.030.63±0.34供试品1组91.40±1.2055.40±7.5025.90±4.9012.60±4.101.74±0.432.69±0.330.02±0.030.76±0.55供试品2组92.80±0.80①56.90±7.5022.80±6.0011.90±2.202.55±0.622.71±0.590.01±0.020.94±0.53供试品3组88.80±5.4057.10±9.7030.50±6.1013.40±3.502.59±0.523.01±0.950.02±0.020.78±0.51供试品4组86.90±2.5054.30±7.5026.80±4.7013.80±4.102.04±0.691.75±0.410.01±0.020.69±0.55供试品5组90.20±3.3053.90±6.4028.60±7.0012.90±2.801.97±0.532.82±0.560.03±0.040.80±0.63

①与阴性对照组比较，P<0.05。

①Compared with negative control group,P<0.05.

本研究通过已知的具有致敏性的几种阳性药对免疫细胞表面分子的表达影响的检测，建立小鼠PLNA的检测平台。应用这些与阳性药致敏性密切相关的指标来评价中药注射剂的致敏性。PLNA结果显示5批中药注射剂中，仅有1批WI有增加的趋势，且T淋巴细胞比例升高，提示这批样品引起了淋巴结的增大和T淋巴细胞的增殖，具有一定的致敏潜在风险，而其他批次供试品指标的变化均差异无统计学意义，与ASA的结果基本一致，但PLNA的方法比传统的ASA灵敏度更高。

小鼠PLNA可以更早期地对药物致敏性给予预测和评价，该检测手段不但灵敏度高，而且简便、快速。通过致敏指标的检测可以对致敏的原因和类型进行诊断，减少传统过敏实验中激发实验给动物带来的安全风险和痛苦。