血清蛋白质组学技术及在肿瘤研究中的应用进展

喻小燕 石星云 陈锋菊

(1、湖南信息职业技术学院,湖南 长沙410200 2、湖南省肿瘤医院，湖南 长沙410013 3、湖南第一师范学院,湖南 长沙410205)

蛋白质组(proteome)是指“1 个细胞或1 种组织其基因组所能表达的全部蛋白质”，是1994 年由澳大利亚Macquarie 大学的Wilkins 与Williams 提出的[1-2]。蛋白质组学是指以蛋白质组为研究对象，从整体的角度，分析细胞内动态变化的蛋白质组成及其活动的规律[3]。而血清蛋白质组学是近年来众多蛋白质组学中非常重要的分支之一，主要是研究如恶性肿瘤患者等特定人群的血清中表达的所有蛋白质，并在此基础上建立正常蛋白表达谱（PEM），找出不同的蛋白点，鉴定和发现疾病相关蛋白，为研究疾病发生机制、早期筛选或诊断标志物、治疗靶点等探寻新方法。血清是血浆凝固后析出的上清，其组成非常复杂，有近万种蛋白质，富含各种蛋白质和一些小分子，如盐、脂类、氨基酸、糖等。血清中的蛋白质能反映机体中细胞器官等运转状态是否异常，蕴含着与疾病的发生发展机制、早期诊断、药物治疗靶点、治疗效果监测紧密相关的大量信息。生理医学诺贝尔奖获得者Lee Hartwell 博士指出：寻找肿瘤标志物，特别是其中的蛋白标志是早期诊断癌症的最新、最有效的方法，而验血诊断简便易行[4-5]。蛋白质组学技术的不断进步、发展和完善为寻找血清中与肿瘤相关的蛋白质及探寻肿瘤发病机制、疗效评估等提供了新的方法和技术平台。

1 血清蛋白质组学研究的基本技术

1.1 双向凝胶电泳- 质谱技术(2-DE-MS)

双向凝胶电泳简称双向电泳，是蛋白质组学研究最基本最常用的实验技术[6]。它是由OFarrell 等于1975 年最早建立，其基本原理为：在相互垂直的两个方向上，根据蛋白质等电点和蛋白质分子量的差异，先利用等电聚焦电泳分离不同等电点的蛋白质，再采用十二脘基硫酸钠- 聚丙烯酰胺凝胶电泳，最终把不同蛋白质彻底分离。这种技术因使用胶条不同，分离蛋白质量也会随之发生变化，利用PH3-10 的梯度胶条可以分离差不多一至三千个蛋白质，而如果使用较窄的胶条PH4-7 可以分离出更多的蛋白质。双向电泳具有高通量、高灵敏度、较高分辨率、有一定重复性，以及能与质谱联用等优点，在血清蛋白质组学研究中得到了广泛的应用。

1.2 差异凝胶电泳- 质谱技术(2D-DIGE-MS)

差异凝胶电泳技术是基于二维凝胶电泳的一项重大创新，其基本方法为：用不同的荧光染料对两个样品的蛋白质进行标记后混合，再进行二维凝胶电泳。由于两种荧光染料的波长相异，两种样品可在同一块胶上分离，其含量差异也能准确测出。由于是在同一个二维凝胶样品中来分离，能够有效地减少经典的二维凝胶电泳中的偶然性，也能在一定程度上克服重复性不够好的缺点，较大程度提高了结果的准确度、可靠性、重复性和工作效率[6-7]，而且此技术可检测到100-200pg 的蛋白质，蛋白质亚型也有可能检测出来，这相对于其它蛋白质组技术来说，具有明显优势。

1.3 液相色谱一质谱联用技术(LC-MS/MS)

液相色谱质谱联用是将待分析的复杂蛋白质样品经蛋白酶消化后，然后用一维或多维色谱进行预分离，用质谱对肽段混合物进行鉴定分析。高效液相色谱（HPLC）质谱联用是以经典的液相色谱法为基础，发展起来的分离分析技术，HPLC 分离的液体多肽混合物在高压下通过细针孔[8-9]，进行质谱分析。HPLC 为复杂蛋白质的分离提供了一种高效的分离方法，依据蛋白质生物学、理化性质的不同，高效液相色谱具有如离子交换色谱、反相色谱、亲和色谱（AC）等许多不同的分离模式。一维液相分离系统能较好的分离简单的生物大分子混合物，但因受到其分离模式所能提供的分辨率和峰容量等因素影响，分离较为复杂的蛋白质、多肽混合物等还是受到一定的限制。目前，大家逐渐采用多维色谱分离技术，并将其与质谱联用技术相结合，以弥补2-DE-MS 的不足，多维液相分离系统可以不做蛋白质变性等预处理，因此在预处理过程中有些可能丢失的蛋白也可检测出来，还能等同分离低丰度蛋白质、高丰度蛋白质，也能分离疏水难溶性蛋白质、低含量蛋白质，并且可重复性好、自动化程度高，为发现、筛选新的与肿瘤相关的血清蛋白标志物打下了良好的基础。

1.4 表面增强激光解析离子化- 飞行时间质谱技术（SELDI-TOF-MS）

SELDI-TOF-MS 是一种基于亲和力的质谱分析方法。其基本原理是：利用特定的探针表面或芯片直接捕获待测样品中的蛋白质分子，洗脱非特定结合蛋白，利用脉冲氮激光能量将捕获的靶蛋白从芯片表面电离出来，根据其在电场中飞行时间的不同，绘制成质谱图，样品中各种蛋白质的分子量、含量等信息可通过分析软件处理其检测结果而获得。SELDI-TOF-MS 有许多优点：可以直接检测未经处理的粗样品，如血清，鉴定特异标志物和分离蛋白质，对样本需要量少，分析速度快，一般几十分钟就能完成，可以分析2-DE 技术不能分析的蛋白质，对含量级微的蛋白，即使含量水平为10-18，只要能够与表面探针有效结合，都能有希望检测到，大大提高了低丰度蛋白的检出率[10-11]。SELDI 技术因其能够全自动、大规模、粗样品、极微量、较高通量筛选蛋白质，已被广泛应用于寻找特异蛋白质或生物标志物，寻找不同类型的组合蛋白质质谱，进行相关疾病的研究和诊断。

血清蛋白质组学研究技术种类繁多，各有优缺点。单一的技术平台已经很难达到最佳的分离鉴定效果，即使是同一类技术平台也必需根据样品进行适合的选择，如色质串联进行蛋白质定性定量分析，就有稳定性同位素亲和标签法技术(ICAT)、氨基酸代谢标记技术(AACT)、还有功能强大的同位素标记相对和绝对定量技术(iTRAQ)等，ICAT 技术在定量及差异表达检测上有较大的优势，但也存在一些缺陷，如这一技术无法检测不含半胱氨酸的蛋白质，而iTRAQ 技术在分析不同样品时，重复性和精确性很好，在一定程度上又弥补了ICAT 技术的不足，被广泛应用于血清差异蛋白分析疾病标志物及医药领域[12-13]。不同技术平台和研究策略的结合，可以最大限度地达到最佳的分离鉴定效果。例如，在选择去除高丰度蛋白质、样品预分离系统、分离系统、质谱系统等时，进行适当的比较、修改和调整，以达到最佳的研究策略。

2 血清蛋白质组学在肿瘤研究中的应用

2.1 肿瘤特异血清标志物寻找

从蛋白质组学的角度上讲，肿瘤可以被认为是一种蛋白质缺陷病，其发生、发展过程中分泌的一些关键调节蛋白在血清/血浆中会有量或质的变化，这些蛋白质与肿瘤的发生、发展有着密切的关系。蛋白质组学技术具有高通量的特点，它能筛选肿瘤在发生发展各阶段中基因表达的各种蛋白质，尤其是组织与体液中与肿瘤相关的低丰度蛋白质，从而可以发现与肿瘤相关的标志性蛋白质分子。由于血清样本获取相对简单，且采集过程基本上不对研究对象造成伤害，越来越多研究人员以血液为样本，应用蛋白组学技术寻找和筛选肿瘤特异血清标志物。Rui 等[14]通过双向凝胶电泳和质谱技术对乳腺癌患者和健康人员血清比较分析时，发现表达差异明显的2 种蛋白质，分别是在乳腺癌患者血清中表达明显下调的14-3-3Sigma 蛋白，上调的热休克蛋白27，而用这2 种蛋白质对患者进行筛查时，两种蛋白的敏感性和特异性分别为100%和97%，提示血清蛋白质可用于高危人群和一般人群的筛查。Kadowaki M[15]等对乳腺癌患者血清蛋白质进行研究时，采用不同分离分析技术，经双向凝胶电泳、LC-MS/MS 鉴定出33 个差异蛋白，Western blotting 结果显示乳腺癌患者血清中玻璃粘连蛋白含量明显升高，提示其可能是乳腺癌早期诊断的血清标志物。张晨曦，刘晓燕等[16]收集乳腺癌患者和健康人血清各10 例，采用双向凝胶电泳和质谱技术成功分离鉴定4 个表达差异的蛋白点：锚蛋白-3 亚型X7、keratin、type I cyto-skeletal9 、核膜血影重复蛋白 2 亚型X 11、Dynein heavy chain10 , axonem a1iso-form X9, 这4 种与乳腺癌发生发展可能相关的差异蛋白质，提示可能成为乳腺癌的早期诊断标志物。Ahmed N 等[17]应用双向凝胶电泳联合质谱的方法分析卵巢癌患者与健康志愿者血清蛋白质时，鉴定了一些表达差异的蛋白质，如结合珠蛋白和血清转铁蛋白，通过检测这两种蛋白质在卵巢癌各个病理分期，用化疗方式治疗前、治疗后的表达情况，为卵巢癌的早期诊断和药物疗效监测提供了新的生物标志物。Ramos[18]等采用经典双向凝胶电泳质谱方法鉴定了一个血清间皮相关蛋白，认为是恶性间皮瘤的潜在肿瘤标志物。这些研究都提示双向凝胶电泳联合质谱方法是筛选血清分子标志物的一种强有力的工具。Yu 等[19]利用差异凝胶电泳（2D-DIGE）比较胰腺癌患者和健康志愿者血清标本，质谱鉴定出差异蛋白41 个，其中24 个上调，17 个下调。并验证发现载脂蛋白E，a-1- 抗胰凝乳蛋白酶、inter-a- 胰岛素抑制因子这三个蛋白作为胰腺癌诊断标志的特异性为82.4%-94.1%，但三者联用诊断时特异性达到了100%。Huang 等[20]应用差异凝胶电泳技术对经用免疫亲和层析的去除了高丰度蛋白的乳腺癌和健康人血清进行分析时，发现在乳腺癌患者血清中表达上调的转铁蛋白和表达下调的载脂蛋白等，经临床验证后，转铁蛋白的表达情况与差异凝胶电泳结果一致，结果还表明差异凝胶电泳可以检测出蛋白质亚型，说明与其他技术相比，差异凝胶电泳具有一定的优势。Yang Z 等[21]分析乳腺癌和健康人血清时，应用多维凝集素亲和色谱分离糖蛋白，HPLC-MS/MS 鉴定分离的酶解片段，不仅发现了在乳腺癌和健康人血清中存在差异表达的与蛋白酶抑制、细胞生长、维持内环境有关的蛋白，还检测到了低丰度蛋白质HER-2 的表达。Zhang Q[22-24]等筛查肾母细胞瘤患儿血清中的生物标志物时联用SELDI-TOF-MS、HPLC、2D-LC-LTQ-MS 等技术，发现了可作为儿童肾母细胞瘤中特定的标志蛋白，分别是载脂蛋白C-I 和结合珠蛋白，它们在儿童早期肾母细胞瘤中表达均偏高。这些方法可用于大量筛选血清标志物。最近有报道通过蛋白质组学技术在肾透明细胞癌早期阶段的血清中新的发现。zhang Y 等[25]在分析肾癌患者和非癌症患者血液样本时，应用iTRAQ 标记和LC-MS/MS 技术进行分析发现，差异表达的30 个蛋白质中，在肾透明细胞癌中HSC71过表达。Geissler K 等[26]研究发现早期肾癌与良性肿瘤、其他泌尿系肿瘤或非癌症病人血清中，蛋白质独特表达的有27 种，而且与肾透明细胞癌免疫反应失调有关的为大多数，可作为诊断肾透明细胞癌的生物标志物。Zhang L 等[27]通过与”癌症基因组图谱”数据库交叉验证，发现差异蛋白质11 种，通过免疫组化验证证实潜在的生物标志物可能为小型Ca2+结合蛋白S100家族S10A8 和S10A9 ，可用于诊断肾癌和作为潜在的治疗靶点。

2.2 肿瘤的发病机制、疗效评价、预后评估以及靶向治疗

过去，应用血清蛋白质组学技术研究肿瘤主要集中在发现生物标志物和诊断上，近些年，越来越多的研究人员逐渐向探索肿瘤发病机制、治疗靶点迈进，以此检测、分析标志蛋白和靶蛋白，作为肿瘤疗效评价、预后判断及其药物筛选研究中最新并且最强有力的技术手段。朱敬华等[28]收集晚期肺腺癌患者培美曲塞联合顺铂方案化疗进展组和非进展组的血液，以2-DE-MS 技术成功鉴定到19 个差异蛋白质点，其中丙酮酸激酶M 2 、腺苷酸激酶5 、a-2 抗纤维蛋白溶酶的前体，r 纤维蛋白、氧化固醇结合蛋白相关蛋白3 等可能为化疗疗效预测的生物标志物。赵冠华等[29]取81 例肺鳞癌患者以应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）检测初治晚期SCC患者接受紫杉醇类联合铂类化疗前血清多肽, 并分析其与化疗疗效的相关性，灵敏度为90.0%,特异性为80.0%。伊力亚尔等[30]应用SELDI-TOF-MS 蛋白质芯片技术分析肾癌手术前后血清蛋白质表达水平的变化，并与SVM等生物信息学相结合，最终筛选出5 种具有临床意义的蛋白质，Bel-2 家族细胞凋亡调节蛋白、WAP 二硫化四物核心蛋白、Krueppel 样因子8、单核细胞趋化蛋白、血清β- 淀粉样蛋白4，这五种蛋白质作为生物标志物，预测肾透明细胞癌的灵敏度为87.5%(35/40)，特异度为86.8%(46/53)，这些蛋白在肾癌发病以及进展过程起着致病角色。通过术后动态监测这些差异性蛋白质，发现他们可作为早期预测、术后复发及转移的标志物，在肾透明细胞癌的疗效评价、预后评估以及靶向治疗方面有一定参考价值。Lin 等[31]通过2D-DIGE 比较及质谱鉴定分析胰腺癌患者手术前后血液样本以及术后一年内病情恶化的患者和未恶化的患者的血液样本，发现它们之中有候选预后标志蛋白等差异蛋白，对胰腺癌的治疗和预后观察的研究很有帮助。Yang F 等[32]以肺鳞癌的血清蛋白质组分析了肿瘤相关抗原，鉴定出与肺鳞癌相关的抗原有14 种，并验证了在肺鳞癌中上调的有6 种，提示了他们在肺鳞癌的诊断和治疗中的潜在应用价值。马晓丽[33]等收集52 例诊断明确的局部晚期和晚期食管鳞癌患者治疗前、后血清，利用蛋白质技术同位素标记相对和绝对定量技术（iTRAQ 技术）筛选食管癌放化疗疗效相关的筛选出与肿瘤相关、具有核心作用且介导肿瘤相关通路的优势血清差异蛋白，共筛选出17 个有显著差异的差异蛋白，其中TF、ADIPOQ、PIGR、CD14 等与食管癌疗效相关的重要蛋白质分子群和分子信号通路，为食管癌的精准治疗提供新靶点和新策略。FU 等[34]应用蛋白质组技术研究表明，在肝癌组织中，HSP90a 的表达与临床分期、病理分级、淋巴结转移、疗效监测密切相关。

3 小结与展望

蛋白质组学研究开辟了蛋白质功能和人类疾病研究的新领域，应用血清蛋白质组学技术在肿瘤研究应用取得了一些进展，但相对于蛋白质组学研究诱人的前景来说，目前的研究还很不够，尽管有很多种血液肿瘤标志物被用于肿瘤的研究临床上，，如甲胎蛋白（AFP）用于的筛查肝癌高危人群；糖类抗原125（CA125）应用于筛查卵巢癌早期；前列腺特异性抗原（PSA）应用于筛查前列腺癌的早期等。但这些标志物也不是绝对理想的血液肿瘤标志物，他们对特定类型的癌症并不完全具有特异性，敏感度也不能达到100%，有些标记物水平变化没有早于临床诊断，敏感性低，假阳性率低，在临床应用中，经得住时间与实践考验的标志物亦是少之又少。现在还有多种恶性肿瘤如肾癌等没有可应用于临床的血清特异性标志物，等待更多研究人员的发现、探寻，或者即使有些肿瘤已有研究人员应用血清蛋白质组开展了不少研究，发现或认为找到了一些肿瘤特异性标志物的蛋白质，但有些标志物特异性差，仍缺乏临床验证，应用于作为肿瘤疗效评价、预后判断及其药物筛选研究也不够多。应用蛋白组技术发现、寻找肿瘤血清标志物并应用于疗效评价、药物筛选还有巨大潜力和研究空间，随着血清蛋白质组技术的不断完善和发展，受高丰度蛋白影响低丰度的测定以及极酸碱性和难溶的蛋白质检测等的局限减少，多种蛋白质组技术方法的联用，应用血清蛋白组学技术寻找到肿瘤理想的血清标志物、研究发现肿瘤新的标记物，探索肿瘤治疗靶点、探明肿瘤发生、发展的分子机制、仍具有有难以估量的前景。