14-3-3蛋白在口腔鳞癌中的表达与作用机制研究进展

李 媛，达林泰

口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是头颈部常见的恶性肿瘤，其恶性程度高、局部浸润性强、易发生早期淋巴结转移，淋巴结转移情况是OSCC最主要的预后影响因素。从头颈癌患者的五年存活率来看，无颈部淋巴结转移(pN0)患者五年存活率为85.5%，无淋巴结结外扩散的颈部淋巴结转移患者为62.5%，而有淋巴结结外扩散的颈部淋巴结转移患者则降至29.9%[1]。肿瘤的侵袭转移是多基因参与、多步骤完成的复杂过程。该过程涉及多种信号转导通路，研究相关分子蛋白的表达情况对于阐明OSCC的发生发展机制具有重要意义。

14-3-3蛋白又称酪氨酸3-加单氧酶/色氨酸5-加单氧酶激活蛋白，具有磷酸化的丝氨酸/苏氨酸(pSer/pThr)结合位点，通过与Ser/Thr磷酸化的细胞内蛋白相互作用，可参与细胞内信号转导、细胞周期的调控、迁移、分化、凋亡等过程。研究发现14-3-3蛋白通过结合PI3K(磷脂酰肌醇-3激酶)的p85调节亚基并激活Akt[2](丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶)或使肿瘤抑制基因p53和p21失活来促进癌细胞的存活[3]。在Wnt5a/ROR1信号转导通路中，14-3-3ζ促进慢性淋巴细胞白血病的迁移和增殖[4]。总之，癌症中的14-3-3蛋白主要作为结合其磷酸化靶蛋白的衔接因子，以调节肿瘤的发生发展、转移和侵袭。14-3-3蛋白的生物学功能广泛，并与多个系统如消化系统、神经系统、泌尿系统等疾病以及肿瘤的发生有关，有研究报道14-3-3蛋白可能与OSCC的发生发展有关，本文对14-3-3蛋白的生物学功能及其与OSCC的发生发展关系作一综述。

1 14-3-3蛋白概述

1.1 结构特征

14-3-3蛋白是在真核细胞中普遍表达、高度保守的酸性蛋白家族，“14-3-3”反映它们在二维DEAE-纤维素色谱和淀粉凝胶电泳中的特定迁移模式，分子量在28～33 ku之间，由不同的亚型组成，其种类在不同物种之间有所不同，在哺乳动物中存在7个亚型(α/β，γ，ε，ζ，η，σ和θ/τ)，由不同的基因编码[5]。14-3-3蛋白几乎存在于所有真核生物中，在细胞中多以二聚体形式存在，二聚体中的每个分子都含有独立的分子配体结合通道，从而可以同时结合两个磷酸化的丝氨酸/苏氨酸结合位点，除14-3-3σ外，所有14-3-3蛋白均可形成同源或异源二聚体；14-3-3蛋白是高度螺旋状结构，每个单体含有九个反平行的α-螺旋(H1—H9)，其凹面为H3、H5、H7、H9两亲性配体结合沟，它是14-3-3蛋白与配体结合的结构基础，同时也调节着14-3-3蛋白与配体中的磷酰氨基酸的相互作用[6]。由于14-3-3蛋白可以形成同源或异源二聚体，因此控制14-3-3蛋白二聚化或表达机制的失调可以改变14-3-3蛋白二聚体的平衡，这种不平衡可能破坏细胞稳态，导致14-3-3蛋白靶向途径的激活，促进癌症的发生。

1.2 生物学功能

14-3-3蛋白家族成员与多种蛋白质相互作用，包括转录因子、跨膜受体、生物合成酶、细胞骨架蛋白、信号分子、凋亡因子和肿瘤抑制因子，可对靶蛋白产生深远影响，改变其定位、稳定性、构象、磷酸化状态、活性，或阻断靶蛋白对修饰酶(例如激酶、磷酸酶或蛋白酶)的可及性[7]等。因此，通过调节多种结合配偶体的功能，14-3-3蛋白已经成为许多重要细胞过程中的关键调节成分。人类14-3-3蛋白家族的七个成员通过与特定序列基序内含有磷酸化Ser/Thr残基的信号蛋白形成蛋白质-蛋白质复合物来调节多种细胞信号传导途径，此外，它也可以识别未磷酸化的基序，进一步扩展了与之结合的蛋白谱，使其具有多样性，从而参与多种细胞进程，包括细胞周期、细胞凋亡、代谢、基因表达的转录调控、DNA损伤反应等[8]。综上，14-3-3蛋白的整体作用可分为三类：①稳定特定蛋白的构象或修饰；②调节酶的活性；③调节其靶蛋白的亚细胞定位。

14-3-3蛋白的不同亚型都有其特殊的功能。研究[9]发现14-3-3η几乎仅定位于线粒体，14-3-3γ仅定位于细胞核，14-3-3β、θ、σ定位于细胞质和细胞核，14-3-3ε和ζ几乎完全位于细胞质中。14-3-3σ是目前公认的肿瘤抑制分子，14-3-3σ编码基因的甲基化使其基因沉默，导致14-3-3σ蛋白在肿瘤细胞中持续低表达，会对p53产生负性调节作用并在DNA损伤后维持上皮细胞的G2/M期检测，从而促进肿瘤细胞的增殖生长[10]。而14-3-3γ是通过阻断p53的抑制剂并与它的调节蛋白相互作用来调节p53。14-3-3ζ在乳腺癌、肺癌、肝癌、头颈癌等恶性肿瘤中有表达，它通过与靶蛋白的相互作用，激活或抑制对靶蛋白的修饰，调节靶蛋白的活性[11]。目前的研究中，14-3-3η在类风湿关节炎[12]、脑部肿瘤[13]及心肌细胞[14]中的报道较多。在肝癌标本中，在瘤细胞和瘤内血管中观察到14-3-3η的过度表达，其促进了细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)的磷酸化，阻断14-3-3η或ERK1/2抑制了肿瘤的生长[15]。14-3-3β在肿瘤细胞增殖和凋亡中的具有重要作用，过表达14-3-3β的细胞中观察到各种信号通路的增强激活，包括MEK/ERK级联反应、PI3K/Akt/NF-κB途径等，从而促进癌症的侵袭和转移[16]。研究表明14-3-3θ是一种新型的肿瘤抑制因子，可以作为转移性乳腺癌新疗法的候选预后生物标志物和靶标[17]。14-3-3ε是14-3-3蛋白家族中最保守的成员，它已显示在许多肿瘤中上调并起到癌基因的作用[18]。由此可见，14-3-3蛋白家族的每个成员在癌症发生发展过程中具有重要的生物学功能。

2 14-3-3蛋白参与癌症的机制

2.1 14-3-3蛋白与细胞增殖

不受调控的细胞增殖是肿瘤发生的早期步骤，14-3-3蛋白与具有致癌潜力的各种蛋白质相互作用，包括成员Raf激酶家族[19]。正常细胞增殖通常由细胞表面受体酪氨酸激酶(RTK)启动，Raf蛋白是RTK途径中的关键信号传导中间体，在静息状态下，14-3-3蛋白二聚体通过与Raf蛋白的N—和C—末端位点的结合，维持Raf单体在胞质中处于无活性状态；当发出增殖信号时，14-3-3与Raf的C—末端位点的结合以Ras依赖性方式促进Raf二聚化；14-3-3蛋白与N—末端位点的结合可还抑制Raf激活，起正调节作用。Raf还可以通过突变激活促进异常细胞增殖，其依赖于14-3-3蛋白与C-末端位点的结合，进一步证明14-3-3蛋白在Raf调控中的重要性。

另一种作为细胞增殖关键调节因子的途径是Hippo途径，通过限制增殖和促进细胞凋亡有助于肿瘤的抑制[20]。在经典的Hippo途径中，Lats激酶在YAP/TAZ上产生磷酸化依赖性14-3-3结合位点，磷酸化的YAP/TAZ通过与14-3-3蛋白结合将它们隔离在胞质中而使YAP/TAZ的促增殖功能失活，从而阻止它们进入细胞核与TEAD转录因子相互作用。

在细胞周期中，准确的染色体分离依赖于有丝分裂过程的精确调控。微管抑制剂破坏有丝分裂进程并激活有丝分裂检查点，导致有丝分裂停滞。某些细胞甚至在不适应有丝分裂检查点的情况下也退出了有丝分裂停滞期，称为适应或滑移，并以非整倍性存活，这随着有丝分裂检查点缺陷的存在而增加，并且还可以促进肿瘤发生。研究显示[21]，14-3-3η的表达缺失会增加有丝分裂细胞的凋亡，从而导致对微管抑制剂敏感和抑制非整倍体形成。当HCT116(人类结肠癌细胞系)和U87MG(人类胶质母细胞瘤细胞系)细胞中的14-3-3η减少，并与微管抑制剂联合使用时，它使两种癌细胞系对微管抑制剂敏感。这些结果表明，有丝分裂进程可能需要14-3-3η，并且可以将其与微管抑制剂一起视为一种新型的抗癌策略。

2.2 14-3-3蛋白与细胞迁移

在癌症进展中，肿瘤细胞转移的关键特性是迁移能力，细胞迁移的第一步涉及肌动蛋白细胞骨架的重塑，越来越多参与该过程的蛋白质被鉴定为14-3-3结合配体，激酶(如PKD、Par1b等)在肌动蛋白上产生磷酸化结合位点，从而与14-3-3蛋白结合，抑制这些肌动蛋白的调节功能[7]。在乳腺癌的进展中，14-3-3ζ作为调节TGF-β途径的分子开关，其从早期的肿瘤抑制因子转变为晚期转移的启动子。这种变化是由于14-3-3ζ分别与癌前细胞和癌细胞中的YAP1和β-TRCP结合。靶向14-3-3ζ作用于YAP1和β-TRCP的残基可以预防由TGF-β途径功能障碍引起的癌症和转移[22]。

Han等[23]和Santoro等[24]报道，14-3-3β过表达可以促进小鼠胚胎成纤维细胞系NIH 3T3细胞发生迁移，并通过与整合素(integrin)β家族的共定位 (colocalization)作用，调节细胞粘附，可能在增加肿瘤的侵袭性和运动性上起到相应作用，研究发现，14-3-3蛋白含有一个新的与整合素β家族相互作用的结合位点，因此，丝氨酸的磷酸化或许会阻断14-3-3β与胞质中整合素的相互作用，从而促进细胞信号传递和迁移。

2.3 14-3-3蛋白与上皮-间充质转化

上皮-间充质转化(EMT)是另一种促进癌症进展的生物学过程，在EMT期间，上皮细胞获得间充质细胞的特性，其包括形态学变化、细胞极性丧失、间充质标记物的表达以及侵入和迁移的能力。因此，EMT的一个基本特征是E-钙粘蛋白和其他抑制细胞运动的细胞粘附分子的下调。Snail转录抑制因子可作为EMT事件的主要调节因子，直接调节影响细胞粘附、运动和极性的基因[25]。14-3-3蛋白与EMT调节因子Snail在pT177位点的结合正调节Snail/Ajuda阻遏物复合物，从而下调E-钙粘蛋白的表达[26]。刘颜等[27]的研究结果显示，14-3-3ζ和aPKC-在胆管癌中协同表达，其表达水平与肿瘤分化程度及TNM分期密切相关，14-3-3ζ和aPKC-与E-cadherin表达呈负相关，提示14-3-3ζ和aPKC-可能通过EMT过程促进胆管癌的侵袭转移。调查ErbB2在乳腺癌进展中功能的研究也揭示了14-3-3蛋白作为EMT调节剂的作用，ErbB2和14-3-3ζ的过表达改变了细胞进程，通过促进EMT降低细胞-细胞粘附，增加了正常乳腺上皮细胞的侵袭性质[28]。

3 14-3-3蛋白在OSCC中的表达与作用

口腔癌绝大多数为鳞状细胞癌，发生于舌、颊、口底、唇、牙龈等，OSCC的发生通常经历由正常上皮→上皮单纯性增生→上皮异常增生→癌→转移癌的过程。口腔癌发病率高，且浸润和转移出现较早，很多患者就诊时已成为晚期。研究口腔癌转移过程中相关信号通路的作用和调节因子的表达对其诊断和治疗具有重要的临床意义。

Ralhan等[29]使用iTRAQ标记技术结合多维LC-MS/MS分析，将头颈部鳞状细胞癌蛋白质表达谱与非癌性头颈组织(对照)进行比较，显示14-3-3ζ在恶变前的口腔损伤及口腔鳞状细胞癌中较正常口腔上皮组织中均呈现高表达。另有研究显示，在非转移性(SCC4及HSC2)和转移性(Tu167及MDA1986)口腔癌细胞系中，无论在mRNA还是蛋白水平，14-3-3ζ在转移性细胞系中呈现较高表达[30]。另外，已经确定了287个14-3-3ζ的结合配偶体，表明14-3-3ζ参与调节口腔癌细胞周期、增殖、凋亡、细胞运输和内吞作用的蛋白质网络，并且在口腔癌的进展和转移中发挥重要作用。14-3-3σ由于其在调节p53和在DNA损伤后介导G2/M检查点中的积极作用，因此被认为是肿瘤抑制因子，在许多上皮来源的肿瘤中观察到14-3-3σ的下调。此外，在OSCC中发现14-3-3σ的表达具有角化作用倾向，但没有与角化作用特异性相关[31]。

Jin等[32]在研究中发现舌癌细胞中14-3-3ζ表达增加，14-3-3ζ的过表达促进细胞增殖和迁移，同时通过调节FOXO3a转录因子抑制细胞凋亡，与肿瘤T分期、淋巴结转移和舌鳞状细胞癌(TSCC)预后不良有关。另一项研究表明，14-3-3ζ与NF-κB、β-catenin和Bcl-2结合，进而参与细胞信号传导，导致口腔癌细胞增殖[33]。14-3-3ζ在OSCC癌组织中过表达，其敲低导致促炎细胞因子的表达升高，Stat3与14-3-3ζ直接相互作用，其破坏减轻了肿瘤炎症中14-3-3ζ引起的抑制作用，表明14-3-3ζ可通过OSCC中的Stat3信号传导调节肿瘤炎症和免疫应答[34]。Chauhan等[35]对口腔癌前病变及OSCC进行蛋白质组学分析也显示14-3-3ζ的显著过表达，将其作为生物标志物，构成了OSCC患者的预后分子标志，并开发出风险预测模型，对建立OSCC患者的个性化治疗具有良好的临床适用性。在OSCC中hnRNPD相关蛋白网络的研究中，证实了hnRNPD与14-3-3ζ，hnRNPK和S100A9蛋白质相互作用，参与多个细胞过程：DNA修复、复制、染色质重塑、细胞增殖、RNA剪接和稳定性，hnRNPD表现出与OSCC临床标本中的14-3-3ζ表达显著相关[36]。

14-3-3蛋白是细胞内重要的抗凋亡蛋白。细胞的凋亡过程中起关键作用的是凋亡信号调节激酶1(ASK1)。其中，14-3-3蛋白家族各成员均能与ASK1结合并控制其功能，且以14-3-3ζ最为常见。研究[37]发现14-3-3蛋白对ASK1控制的主要形式是14-3-3蛋白与ASK1共同表达，以抵消ASK1的促凋亡作用。另外，14-3-3蛋白还能结合磷酸化的促凋亡蛋白Bad，使其锚定在细胞浆内，不能与蛋白分子Bcl-2结合，进一步抑制凋亡活化因子细胞色素C(CytC)的释放，最终抑制细胞的凋亡[37]。另有研究[38]通过组织微阵列免疫组化评估了214例头颈鳞状细胞癌病例中的ING4表达，发现HNSCC中ING4的细胞质表达显著增加，并且与淋巴结转移和14-3-3η表达显著相关，结果表明细胞质ING4的增加可能是由于14-3-3η结合所致，也可能参与了恶性进展。

通过以上实验研究和临床观察，表明14-3-3ζ和σ亚型在OSCC组织中都呈阳性表达，它们与OSCC的恶性生物学行为密切相关。所以，研究14-3-3蛋白在口腔鳞癌发生发展和侵袭转移中的关系，可以运用到肿瘤治疗中。

4 14-3-3蛋白与OSCC的靶向治疗

目前口腔癌的综合序列治疗取得了较大的进展，提高生存率及生存质量仍是当今研究热点。14-3-3蛋白参与致癌和抑癌基因的调控在探索新分子靶标与多靶向疗法的研发，具有潜力，有些研究已视14-3-3蛋白为研发新型抗癌药物的靶标[39]。有研究证明了GSK3β/β-catenin信号通路在调控14-3-3σ对舌癌细胞化疗敏感性方面具有重要作用，作为一种负反馈机制，β-catenin/ZEB1增强了14-3-3σ启动子的甲基化水平，从而下调舌癌细胞中14-3-3σ的表达，表明采用下调14-3-3σ的新策略可以增强化学治疗舌癌的临床疗效[40]。在以14-3-3ζ为靶标的被siRNA转染的头颈癌细胞中显示出G2-M停滞，通过诱导细胞凋亡，下调14-3-3ζ可使头颈癌细胞对化疗药敏感[41]。

对于有效的口腔癌治疗，可着手干扰14-3-3蛋白与靶蛋白的相互作用，合成天然抑制剂，例如通过与几种参与细胞凋亡的蛋白(Bad、FKHRL1和ASK1)结合而成为调节信号传导的效应物，文献报道guggulsterone(GS，一种法尼醇X受体拮抗剂)靶向14-3-3ζ相关细胞通路，减少头颈癌中的细胞增殖和诱导细胞凋亡[42]。有研究[43]发现巯氧吡啶锌(PYZ)是抑制OSCC细胞体外增殖和诱导细胞凋亡的最有效的细胞毒剂，用PYZ治疗可降低剂量依赖性的口腔癌细胞集落形成、迁移和侵袭能力，还可以降低14-3-3ζ、14-3-3σ、细胞周期蛋白D1、c-Myc和丙酮酸激酶M2(PKM2)的表达，抑制AKT/mTOR和Wnt/β-catenin诱导细胞凋亡和抗增殖作用的信号通路，用PYZ治疗时14-3-3亚型(ζ和σ)同时丢失，促凋亡蛋白(Bad和Bax)表达增加，诱导凋亡。

疾病复发和远处转移的新标志物的发现可以帮助识别癌症的发展阶段。14-3-3蛋白靶标药物的发现不仅会对涉及14-3-3蛋白的疾病产生治疗性干预，还将扩展我们对其生物学功能的理解。

5 小 结

改进癌症检测和治疗策略的关键是鉴定相关分子和信号转导途径，14-3-3蛋白家族与多种细胞途径的数百种蛋白质相互作用并调节，不仅起到维持正常细胞稳态的作用，而且失调时，会促进癌症的发生发展。14-3-3蛋白可以调节许多重要的蛋白质，很可能在许多正常的细胞功能中起重要作用。因此，14-3-3蛋白功能的全局抑制可能在正常细胞中具有未知的后果。理想的假设，靶向14-3-3蛋白的分子是同种特异性的，破坏它们的二聚化或与特定靶标的结合，或者不是靶向14-3-3蛋白，而是可以针对受14-3-3蛋白调节的靶标进行治疗，对疾病的诊断和治疗具有潜力，也将成为我们今后的研究方向。