LncRNA调控PDLSCs成骨分化的研究进展

孙唯夫，刘 佳，金作林

牙周炎是发生在牙周组织的感染性疾病,主要表现为牙龈炎症、牙周袋形成、牙槽骨吸收和牙齿松动脱落。牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells, PDLSCs)是一种可以从牙周组织分离出的间充质干细胞,具有分化成多种细胞的潜能,包括成骨、成脂、成纤维和成牙骨质等谱系的细胞[1-2]。由于PDLSCs便捷的组织来源和良好的成骨能力,它被视为牙周组织改建和修复的种子细胞[3]。然而炎症微环境会破坏PDLSCs的多向分化潜能尤其是成骨分化能力[4]。近些年发现的LncRNA是一类重要的参与炎症反应的非编码RNA, LncRNA可以在炎症微环境下调控PDLSCs的成骨分化,为利用LncRNA治疗牙周炎导致的牙周组织丧失提供了依据[5]。

1 PDLSCs的生物学特性

1.1 PDLSCs是牙周组织改建和修复的关键细胞

2004年,Seo等利用单细胞克隆技术,首次从牙周膜分离并命名了 PDLSCs,这类细胞属于间充质干细胞[1]。其良好的成骨能力可以修复因炎症丧失的牙槽骨,进而软组织附着改建,起到牙周组织修复的作用[3,6]。干细胞疗法是一种具有很大潜力的牙周组织修复方法,有广阔的临床应用前景[7]。Li等成功将人PDLSCs植入裸鼠的牙周组织,并确定了移植后的有效性和安全性[8]。Iwata使用自体来源的PDLSCs膜片对患者进行牙周组织缺损的治疗,取得显著效果[9]。这些结果都说明PDLSCs在牙周组织的功能维持和缺损组织修复中起到重要的作用。

1.2 炎症对PDLSCs功能的影响

在PDLSCs增殖分化的过程中,凡影响细胞微环境的因素都将破坏PDLSCs的正常功能[10]。在炎症微环境中,PDLSCs会失去成骨潜能,即使脱离炎性微环境,其功能缺失仍然是长期的、不可逆的[4],这与肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α的增高有关[11]。炎症中被高度活化的经典Wnt通路和核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)通路以及炎性因子白细胞介素1(Interleukin-1, IL-1)和IL-6也会抑制炎症环境中PDLSCs(iPDLSCs)的成骨分化[12-14]。有学者正致力于研究同种异体间充质干细胞治疗疾病的可行性,保留拔除的正畸牙和阻生牙,建立PDLSCs细胞库以供临床实验和治疗[9],但目前如何获得状态良好的自体PDLSCs是亟需解决的问题。

2 LncRNA的分子生物学作用

LncRNA是一类核苷酸序列大于200的非编码转录物质,在维持细胞和组织稳态中起重要的调节作用。LncRNA含有模块结构域,通过二级结构或碱基配对的方式与蛋白质、核酸结合,与其它物质相互作用而调节生物体众多的生理过程,包括X染色体失活、干细胞多能性和基因组印记等；同时,它也与众多病理过程有着密切的联系,尤其是炎症反应[15-16]。

LncRNA在生长发育及干细胞分化中起着重要作用。女性生长发育的过程中,两条X染色体中会有一条发生失活称为X染色体失活。LncRNA XIST(X染色体失活特异转录物)可将组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶募集到X染色体上,导致组蛋白甲基化和一条X染色体的沉默[17]。在多能干细胞中,反向编码的LncRNA调节临近基因的转录,影响多能干细胞的分化。反向的LncRNA Evx1as促进其邻居基因EVX1的转录,调节中内胚层分化[18]。

LncRNA在免疫细胞发育、分化和活化的过程中广泛表达,其既可以作为转录调节因子,也可以通过影响其它因子来调节免疫基因的表达,参与免疫调节[19-20]。NF-κB相互作用的LncRNA(LncRNA NKILA)可以抑制血管炎过程中NF-κB/KLF4正反馈回路的活性,起到分子开关的作用,减轻炎症反应[21]。TNF-α和hnRNPL相关免疫调节LncRNA(LncRNA THRIL)在许多人体组织中表达,它与可变剪切因子特异性结合异质核核蛋白L(hnRNPL)形成THRIL-hnRNPL复合物,作用于TNF-α的启动子来调节其转录,影响炎症反应。同时THRIL的表达与川崎病(病理表现为全身性血管炎)症状的严重程度密切相关[22]。综上所述,LncRNA与众多的生理过程有密切的联系,对炎症等病理过程也起关键的调控作用,研究其作用机制对于牙周病患者的口腔治疗具有显著的临床意义。

3 LncRNA调控PDLSCs成骨分化的作用机制

牙周炎对患者最大的损伤就是牙槽骨丧失,这会加重牙周袋形成甚至造成牙齿松动、脱落,而且牙周炎得以控制后,缺损的牙周组织也无法自行恢复。部分口腔医生现致力于利用PDLSCs的成骨能力修复牙槽骨,进而软组织附着、改建,恢复牙周组织正常形态,达到牙周组织再生的治疗目的[7]。LncRNA已被证明对干细胞成骨分化具有重要影响,两者的关系逐渐成为研究的热门[23]。

3.1 LncRNA调控正常PDLSCs的成骨分化

PDLSCs是一种间充质干细胞,具有分化成多种细胞的潜能,在体外培养条件下可以分化为成骨、成脂、成纤维和成牙骨质等谱系的细胞,并且其分化过程受多种因素的调控[10]。在PDLSCs成骨分化前后,有2 171种LncRNA差异表达,很大一部分LncRNA对成骨分化起着调控作用[23]。Gu等发现编码为TCONS_00212979和TCONS_00212984的LncRNA作为内源竞争RNA (competing endogenous RNA, ceRNA), 与mRNA竞争微小RNA(MicroRNA, miRNA) 34a和146a的结合位点,通过丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路调节PDLSCs的成骨分化。同时也提出了LncRNA-miRNA-mRNA调控网络,为以后深入地研究机制奠定了基础[24]。

部分LncRNA抑制了PDLSCs的成骨功能：LncRNA MEG家族与PDLSCs的成骨分化关系密切,MEG8、MEG3和MIR22HG都抑制PDLSCs的成骨分化,其中MEG3通过与BMP2的mRNA竞争hRNPI来降低BMP2水平而起作用[23,25]。Jia等研究发现,下调LncRNA ANCR能抑制经典Wnt通路,促进PDLSCs的成骨分化,ANCR本身具有抑制成骨的作用[26]。其中一种机制是LncRNA ANCR直接作用于miRNA-758来降低其对Notch的抑制作用,进而兴奋经典的Wnt通路,下调ANCR会抑制Wnt通路[27]。ANCR对于经典Wnt通路是否存在其它作用机制有待进一步的研究。有学者研究发现RNA结合蛋白(RBP) Lin28A上有多个牛磺酸上调因子-1 LncRNA(LncRNA TUG1)的结合位点,TUG1与其相互作用的结果抑制了PDLSCs的成骨分化过程[28]。

同样,研究者也发现具有积极作用的LncRNA：miR-106a-5p可以抑制PDLSCs的成骨分化,miR-106a-5p上存在LncRNA PCAT1的结合位点,PCAT1的过表达会抑制miR-106a-5p,上调miR-106a-5p的靶基因骨形态发生蛋白-2(BMP2)的表达[29-30],BMP2是一个重要的分化诱导因子,能激活Smad家族,促进PDLSCs的成骨分化和骨组织的再生[31]。不仅如此,miR-106a-5p的另一个靶基因E2F5可以促进PCAT1的表达,形成了一个针对BMP2的前馈调控网络,该研究首次提出LncRNA-miRNA-细胞因子的前馈调控网络[30]。Xu等通过慢病毒转染的方法调节LncRNA TWIST1在PDLSCs中的表达,证实其可以促进PDLSCs的成骨分化[32]。

LncRNA通过多种途径和方式调节PDLSCs的成骨分化,且涉及众多分子,需要更多的研究来明确其机制。

3.2 LncRNA调控牙周炎环境下PDLSCs的成骨分化

LncRNA的表达与疾病的发展密切相关,研究LncRNA调控iPDLSCs成骨分化的机制对于应用自体PDLSCs进行干细胞治疗具有重要意义。2014年,Zou等首次证明了慢性牙周炎组织中LncRNA与相邻正常组织的表达存在差异[33],说明LncRNA在牙周炎的发病机制中有重要作用。LncRNA也与牙周炎的复发有关,高水平的LncRNA MORT可以降低牙周炎的复发率[34]。目前的研究发现一些促进iPDLSCs成骨分化的LncRNA。

炎症作用下PDLSCs中存在大量差异表达的LncRNA和新出现的LncRNA,这些LncRNA与间充质干细胞的发育和分化有关,其中许多差异表达的LncRNA作为ceRNA与miRNA形成调控网络,调节靶基因的蛋白质编码,影响细胞的生物学功能[35]。Mir-182可通过Foxo1负性调节成骨分化[36],Wang等[5]发现LncRNA-poir、mir-182和Foxo1高度相关：在牙周炎环境下,LncRNA-poir通过竞争性抑制miRNA-182的表达,增强靶分子Foxo1的表达,Foxo1又与TCF-4竞争β-catenin来抑制经典Wnt通路,促进iPDLSCs的成骨分化,形成LncRNA poir- mir182- Foxo1的调控网络。此外,炎症中被高度活化的NF-κB通路会影响LncRNA-poir和mir-182调控网络的平衡。

LncRNA ptcsc3是Toll样受体(Toll-like receptors, TLR)4的上游抑制剂,通过下调TLR4间接调节牙周病原体的免疫识别,其过度表达会抑制iPDLSCs的增殖[37]。值得注意的是,ptcsc3和TLR4的表达水平仅与iPDLSCs显著相关,而与正常的PDLSCs不显著相关,因此ptcsc3和TLR4之间可能存在某些病理介质；而且在神经胶质瘤细胞中,ptcsc3可以抑制经典Wnt通路的活性,其在iPDLSCs中能否对Wnt通路起到同样的抑制作用进而促进iPDLSCs成骨分化,这有待今后进一步的研究[38]。上文提到的LncRNA TWIST1对于iPDLSCs也起促进成骨分化的作用[34]。

综上所述,在炎症环境中,LncRNA对iPDLSCs的成骨分化有着重要的调控作用,运用LncRNA的调控作用改善iPDLSCs的成骨分化能力是临床开展干细胞治疗的潜在方法,但首先要将LncRNA的调控网络研究得更加明确。

4 结 语

治疗牙周炎造成的牙周组织丧失是临床工作中的一大难题,目前利用组织工程学技术再生牙周组织是一种极具潜力的疗法。作为间充质干细胞的牙周膜干细胞(PDLSCs)，因其多向分化潜能和自体源性而进入研究者的视野,逐渐成为研究热点。它具有修复缺损牙周组织的能力,其中最重要的是成骨能力,但炎症环境下的PDLSCs的成骨能力明显下降,并且在脱离炎症环境后也无法恢复。在临床实践中,医生很难从牙周炎患者的口中取得健康的PDLSCs,恢复炎症环境下PDLSCs的成骨分化能力并促进牙周组织再生是解决这一问题的关键。LncRNA已被证明在健康和炎症环境下对PDLSCs的成骨分化都起着重要的调控作用,其机制复杂多样,涉及的分子及信号通路广泛且相互影响,尚未形成明确的理论体系,LncRNA可以作为关键的治疗靶点进行研究。