下一代测序技术在结直肠癌诊疗中的应用

陈如萍，刘蕊

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是世界第三大常见的恶性肿瘤，发病率和病死率分别位于全球癌症第 3 位和第 2 位［1］。我国 CRC 患者亦呈逐年上升趋势。肠镜检查是肠道肿瘤最有效的筛查方式，但由于我国肠镜筛查还不够普及，CRC 早期确诊病例占比低，不能及时发现并干预，导致5年生存率低于发达国家。如今，临床对更具优势的遗传学筛查和检测技术的需求日益增长。下一代测序（next generation sequencing，NGS）技术是大规模平行测序技术的总称，其检测通量高、速度快、准确度高且信息量丰富［2］。大规模的基因组测序提高了人们对核酸功能的理解，利用NGS 鉴定大量突变位点更加切合实际［3］。因此，NGS 用于CRC 的筛查、诊断、治疗及预后判断具有较大的应用价值与前景。在临床实践中通过单次测序即可同时获得与CRC 有关的多个基因序列或全基因组信息，从而有助于临床决策的制定［4］。

1 遗传性CRC基因携带者的筛查

1.1 CRC的常见突变基因 体细胞基因突变，尤其是驱动基因突变导致的癌基因激活或抑癌基因失活，在恶性肿瘤的起始、发展和转移过程中起关键作用［5］。具有明确遗传基因突变的CRC仅占全部病例的5%左右，如Lynch 综合征（Lynch syndrome，LS）、家族性腺瘤性息肉病（familial adenomatous polyposis，FAP）、Gardner综合征、P-J综合征等，若直系亲属有上述病史，建议利用NGS检查相应基因，以实现CRC的早期干预［6］。

癌症基因组图谱计划（the cancer genome atlas，TCGA）显示，在CRC 肿瘤标本中除了已知的APC、TP53、RAS（KRAS、NRAS）、BRAF、PIK3CA等常见突变外，ARID1A、SOX9、FAM123B/WTX、CD44、DCC等突变及HER2、IGF2等扩增的频率也较高［7］。Díaz-Gay 等［8］对特定CRC 的全外显子组测序数据综合分析，得出BRCA2、BLM、ERCC2、RECQL、REV3L和RIF1是参与种系突变导致家族性CRC 易感性的潜在候选基因。

遗传性 CRC 最多见的是 LS、FAP 和 MUTYH 相关性息肉病（MUTYH-associated polyposis，MAP），分别表现为DNA 错配修复（mismatch repair，MMR）基因（MLH1、MSH2、MSH6、PMS1、PMS2）、APC、MUTYH突变。LS占CRC病例的2%～5%，Lynch阳性者患大肠癌的风险高达80%，其主要分子基础是MMR突变，进而导致大范围微卫星不稳定（microsatellite instability，MSI）［9］。《遗传性结直肠癌临床诊治和家系管理中国专家共识（2018）》建议：初诊CRC 患者应检测微卫星状态，初筛为MSI 则应行MMR和EPCAM检测。NGS 能够识别突变基因，联合NGS 与生物信息学、细胞和分子生物学以及动物模型等功能基因组学方法有利于推动对多种遗传突变体致病性的解释［10］。临床可利用NGS 进行突变基因筛查，作为早期发现CRC的方法之一。

1.2 NGS用于CRC基因突变检测的临床价值 NGS逐渐成为肿瘤分子诊断的有力工具［11］。Bai 等［12］强调了靶向NGS 的重要性，通过Ion Torrent 测序平台分析 91 例直肠癌，结果显示KRAS、TP53、APC、FBXW7、PIK3CA频繁突变，BRAF、CTNNB1、ERBB2和SMAD4突变程度较轻；该研究还发现多重突变，主要涉及KRAS和APC或KRAS和TP53。Zhang等［13］利用基于逆转录探针的靶向NGS鉴定来自中国的早发性或家族性CRC 患者的高外显率种系突变，该方法可识别7 种CRC 易感基因的突变，包括APC、MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、MUTYH和NTHL1，此方法的敏感度（99%）和特异度（98%）均较高。

黄凯等［14］使用多重 PCR 靶向富集结合 NGS 技术对17例CRC病例和14例正常样本的MMR基因进行检测，在外显子区域共发现15 种突变，与Sanger测序验证结果一致，而NGS更节约时间和成本，说明该技术适合MMR基因突变筛查。李丽娟等［15］使用Ion Torrent测序仪检测108例CRC病理样本的KRAS基因状态，并与作为金标准的Sanger测序比较，符合率为94%，特异度为91.5%，敏感度高达100%，证实了 NGS 的临床应用价值。同样，Gao 等［16］使用 Ion Torrent PGM 系统测定 51 例 CRC 组织的KRAS突变，该系统针对KRAS外显子2 突变（13/51）显示出与Sanger 测序100%的一致性，特异度和敏感度均较高，适用于临床常规检测。Wang等［17］验证基于扩增子的靶向NGS对CRC组织的分析性能，在中值测序深度≥500 X 时，特异度为100%，敏感度为95%～100%；随后，在大型多中心研究中获得648 例中国CRC 患者的突变谱，鉴定出TP53（52.82%）、KRAS（46.68%）、APC（24.09%）、PIK3CA（18.94%）、SMAD4（9.47%）、BRAF（6.15%）、FBXW7（5.32%）、NRAS（4.15%）以及其他不常见的突变基因；此外，检测到特定突变基因与某些临床病理学特征具有相关性，如BRAF和PIK3CA在右半结肠癌中更普遍。以上研究明确了NGS 应用于CRC 突变基因检测的可行性、准确性和实用性。

2 转移性结直肠癌（mCRC）的靶向治疗

2.1 mCRC 的抗表皮生长因子受体（epithelial growth factor receptor，EGFR）治疗 EGFR 的活化可激活 Ras/Raf/MEK/ERK/MAPK 和 PI3K/AKT/mTOR两条胞内信号传导通路，在细胞生长、增殖、迁移和血管生成等过程中发挥重要作用。EGFR 通路在恶性肿瘤中可过表达或异常激活，与肿瘤进展和预后有关，因而成为治疗的有效靶点。该通路可由KRAS、NRAS、BRAF或PIK3CA的突变持续激活，导致mCRC 患者对抗EGFR 单克隆抗体治疗的耐药［18-19］。此时，可以根据肿瘤组织的基因分型来指导靶向治疗。

在众多基因中，KRAS与CRC 高度相关，30%～40%的CRC 患者伴有该基因突变。KRAS基因已被《NCCN临床实践指南》列为CRC靶向治疗的必检项目，mCRC 患者需先检测该基因突变情况继而指导临床用药。如KRAS突变介导抗EGFR单抗的耐药，则患者不应接受抗EGFR 治疗。同样，《ESMO 共识指南》建议在抗EGFR 药物治疗前对KRAS和NRAS的外显子2、3和4以及BRAF的外显子15进行检测，不建议突变者使用上述靶向药物［20］。目前针对RAS突变型肠癌，抗血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）单抗联合化疗仍是主要治疗手段。

由于靶向治疗的复杂耐药机制，许多患者会对指南推荐的治疗药物产生耐受。Hou 等［21］针对57例中国CRC患者的508种肿瘤相关基因行基于杂交捕获的靶向NGS，该研究中突变最频繁的基因是APC（68.4%）、TP53（56.1%）和KRAS（52.6%）；57.9%的 CRC 患者存在KRAS、NRAS和BRAF突变，17.5%具有上述基因野生型的患者存在PTEN、PIK3CA和HER2突变；在12.3%的患者中鉴定出HER2扩增，可诱导下游信号激活并导致西妥昔单抗或帕尼单抗耐药，因而无法从抗EGFR 治疗中获益；此外，EGFR、FGFR1、PDGFRA和MAP2K1突 变 也 被 认 为 是 抗EGFR耐药的主要潜在机制。由此可知，NGS或可成为判断肿瘤突变谱以指导晚期CRC 患者个体化治疗的关键。

2.2 局部晚期病例的新辅助化疗 局部晚期CRC的标准疗法包括新辅助化疗（neoadjuvant chemotherapy，NACT），NACT 联用靶向药物可为患者带来生存获益，但此方法并非适合所有患者。对于是否需要实施NACT 联合靶向治疗，应先进行肿瘤组织的基因突变检测，再结合各项检查结果、患者病情进展等具体情况进行综合评估。

目前，肿瘤内异质性（intratumoral heterogeneity，ITH）已被认为是化疗和放疗抵抗的机制。基于突变等位基因肿瘤异质性（mutant-allele tumor heterogeneity，MATH）的NGS 算法可作为衡量ITH 的指标，为CRC 的靶向治疗提供潜在的生物标志物［22-24］。Greenbaum等［25］应用NGS检测局部晚期直肠癌患者ITH 与NACT 疗效之间的相关性，证明了较高的MATH 评分与NACT 较差的治疗反应有关。由此可见，术前使用NGS进行分子筛选，通过MATH值量化肿瘤异质性程度，便于临床医生为患者制定更加合理有效的治疗方案。

3 CRC的疗效预测及预后

3.1 联合RAS、BRAF检测 NGS 技术对 CRC 的疗效预测及预后有一定的指导意义，有助于临床医生进行随访和管理。在mCRC的常规化疗中加入靶向药物可提高疗效，对于RAS/BRAF野生型病例，GALGB 80405Ⅲ期研究提示西妥昔单抗更宜联合FOLFOX（奥沙利铂+亚叶酸钙+5-氟尿嘧啶），贝伐珠单抗更宜联合FOLFIRI（伊立替康+亚叶酸钙+5-氟尿嘧啶），左半结肠癌患者的预后较好［26］。临床研究表明，若采用EGFR 单抗治疗，RAS、BRAF的突变状态会影响治疗策略的有效性，被推荐为预测抗EGFR 疗效的重要指标，使用抗EGFR 治疗的RAS/BRAF野生型患者的应答率（response rate，RR）、无进展生存期（progression-free survival，PFS）和总体生存期（overall survival，OS）均有改善，但在左右半结肠癌疗效差异的问题上仍存在争议［27-28］。

Vidal 等［29］利用 NGS 评估抗 EGFR 治疗联合化疗 时RAS、BRAF、PIK3CA和EGFRS492R突 变 的mCRC患者的疗效，发现4种基因均为野生型的患者反应良好。Gong等［30］从138例mCRC中鉴定出一种新型KRAS突变（KRASR68S1），与预后较差有关。Jones 等［31］对 9 643 例 mCRC 行 NGS，旨在评价非V600BRAF突变的影响，在接受检查的患者中，非V600 突变比例为2.2%（208 例），占全部BRAF突变的22%，与CRC亚型明显相关且预后较好，表明NGS在mCRC的预后评估中具有重要参考价值。

Taieb等［32］采用AmpliSeq分析PETACC8临床试验（FOLFOX+/-西妥昔单抗）中2 559 例Ⅲ期CRC 病例的RAS和BRAFV600E 突变，明确 908 例为阳性，其余1 651 例中有1 054 例进行了NGS 检测，分别有227 例（21.5%）和46 例（4.4%）新诊断为KRAS/NRAS和BRAF突变，使用FOLFOX+西妥昔单抗治疗的RAS/BRAF野生型患者预后较好。随后，Bruera等［33］采用Ion Torrent 对一线FIr-B/FOx（5-氟尿嘧啶与交替伊立替康/BEV 或奥沙利铂）+贝伐珠单抗三联化疗的mCRC 患者行KRAS/NRAS/BRAF分析，结果显示KRAS外显子 2～4（KRAS2～4）、NRAS外显子 2～4（NRAS2～4）、BRAF外显子15（BRAF15）突变体普遍存在。Yang 等［34］对 1 例KRAS/NRAS/BRAF野生型mCRC 患者建立患者源性异种移植模型，经NGS 检测出HER2扩增以及激活突变S310F，试验显示阿法替尼疗效显著，后续随访该患者达到3 个月PFS 和临床症状缓解，且无严重的不良反应。以上研究进一步表明高敏感度的NGS能够动态监测基因突变谱的变化，据此可对治疗方案进行实时调整，从而更密切地预测疗效和预后。

3.2 联合MSI 检测 微卫星高度不稳定性（microsatellite instability-high，MSI-H）已是公认的Ⅱ期CRC 的预后及化疗疗效预测因子。具有MSIH 表型的Ⅱ期CRC 患者预后较好，不建议使用氟尿嘧啶类单药辅助治疗［35-36］。近年来，NGS 的进步实现了MSI状态的检测［37］。Kim等［38］探讨靶向NGS对MSI的识别能力，分析382个具有已知MSI的CRC样本，鉴定出验证组的8个MSI-H，选择体细胞突变负荷截断值≥40 且I 指数≥9%作为检测标准具有较高的敏感度和特异度。另外，为了探究MSI 的预后价值，Innocenti 等［39］在贝伐珠单抗联合化疗或西妥昔单抗联合化疗的一线治疗mCRC 患者的疗效研究（CALGB/SWOG 80405）中利用NGS评估贝伐珠单抗与西妥昔单抗的疗效差异，结果表明，对存在MSI-H的患者而言，贝伐珠单抗组比西妥昔单抗组的OS更长。若贝伐珠单抗联合化疗的益处得到进一步证实，该方案有望改善mCRC的预后。

3.3 联合外周血循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）检测 NGS 技术所用的检测标本大多为肿瘤组织，有创且难以反复获取。然而，ctDNA可以先于影像学检查提示肿瘤复发及转移，基于ctDNA的NGS算法也能为肿瘤组织取样困难或不足的晚期CRC患者提供新的选择［40］。Osumi等［41］指明了ctDNA在CRC预后中的意义，表现为CRC的疗效评估、复发转移预测以及耐药监测等方面。Zhang等［42］利用 NGS 测定西妥昔单抗治疗的 15 例 CRC 患者外周血ctDNA 并以微滴式数字PCR 作为对照，NGS 的敏感度和特异度分别为87.5%和100%。基于NGS 的ctDNA 检测在鉴定基因组变异时更具优势，可用于CRC 患者西妥昔单抗治疗期间的实时监测。

近年来，基因组学的进展拓宽了NGS 技术从基础科研到临床实践中的应用。NGS技术不仅有助于阐明CRC 的发病机制，而且能够提供相关基因位点的突变信息，从而用于筛查高危人群，实现早期诊断，指导精准治疗，判断疗效及预后。虽然NGS仍处于起步阶段，但前期研究已显示其良好的应用前景。相信随着高通量测序数据库的建立、法律法规的完善以及统一检测标准的制定，NGS 将会更广泛地应用于临床，为CRC的诊疗提供参考。