植物中γ-氨基丁酸的代谢及富集机制

王姗姗 刘小娇 胡赟 靳玉龙 白婷 朱明霞 张玉红

摘要 γ-氨基丁酸（GABA）由于功能多样，日益受到人们的关注。简述了植物中GABA代谢途径及植物富集GABA的方法与作用机理。植物中GABA合成主要包括GABA支路和多胺降解途径，分解代谢则是在GABA-T和SSADH的催化作用下生成琥珀酸。植物主要通过调节植物体内GABA的合成-分解代谢实现GABA累积。GABA富集方式主要为浸泡、发芽，并通过盐胁迫、缺氧胁迫、冷胁迫、热胁迫、高压、超声等手段的联合使用进一步增加富集量。GABA富集机制包括增加底物含量，如谷氨酸;增强GABA合成关键限速酶活性，如通过调节内环境pH或Ca2+浓度，增强GAD活性;改变细胞内区室划分，增强底物和酶的相互作用;抑制GABA分解代谢。

关键词 γ-氨基丁酸;代谢途径;胁迫处理;发芽;富集机制

中图分类号 Q946文献标识码 A文章编号 0517-6611（2020）24-0009-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.24.003

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Metabolism and Enrichment Mechanism of γaminobutyric Acid in Plants

WANG Shanshan， LIU Xiaojiao， HU Yun et al

（Institute of Food Science & Technology， Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences，Lhasa，Tibet 850000）

Abstract Because of the various functions， γaminobutyric acid has attracted increasing attention. The GABA metabolic pathway in plants and the method and mechanism of GABA enrichment in plants were briefly described.The synthesis of GABA contained two pathways， GABA shunt and polyamine degradation. The catabolism of GABA to succinic acid was catalyzed by GABAT and SSADH. The enrichment of GABA was mainly based on regulating the synthesis and catabolism of GABA in plants. The methods contained soak and germination， the more accumulation of GABA could be obtained by the additional processing ，such as salt stress， hypoxia stress， cold stress， heat stress， high pressure， and ultrasound. The mechanism of GABA enrichment included： increasing substrate content， such as glutamic acid;enhancing the ratelimiting enzyme activitiy of GABA synthesis， such as enhancing GAD activity by adjusting the internal environmental pH or Ca2+ concentration;changing the compartmentalization of cells to enhance the interaction between substrates and enzymes;inhibiting the catabolism of GABA.

Key words γaminobutyric acid;Metabolic pathway;Stress treatment;Germination;Enrichment mechanism

γ-氨基丁酸（GABA）是一種广泛存在于植物、动物及微生物的四碳非蛋白质氨基酸[1]。GABA作为一种哺乳动物神经系统的神经递质，在维持心理健康方面发挥着重要作用。临床研究表明，GABA具有降压、降脂、降血糖、抗癌、利尿、镇定等功能[2]。GABA同样可以通过改善氧化应激反应，减少高脂饮食小鼠的肥胖概率[3]。由于GABA的功能多样性，商场中存在部分富含GABA的产品，如发芽糙米，但种类较为单一，难以满足消费者需求。

GABA 在植物中具有多种功效，可调节植物机体pH，促进代谢生长发育，提供三羧酸循环旁路的代谢产物，抵御逆境等，当植物体受到外界胁迫如热刺激、冷冻、机械损伤、盐胁迫、缺氧、浸泡和酸化等逆境胁迫或植物激素作用时，植物体内 GAD 酶被激活而引起酶活力的增强，导致GABA富集[4]。GABA存在于多种作物，如谷物（糙米、大麦等）、豆类（大豆、绿豆等）、蔬菜（马铃薯、番茄等）、坚果等[5]。不同的作物中，GABA含量各不相同，为2～700 nmol/g[6]。提升食品中GABA含量越加受到人们的关注，了解植物中GABA的代谢及富集机制，有利于高GABA含量产品生产工艺的确定，丰富高GABA产品种类，满足消费者需求。

1 植物中GABA代谢途径

植物中GABA代谢途径主要包括GABA支路和多胺降解途径。目前对于植物GABA富集的研究主要集中在GABA支路，对于多胺降解富集GABA缺乏系统研究。

1.1 GABA支路

植物中，GABA支路是指由谷氨酸脱羧酶（GAD）催化谷氨酸形成GABA和CO2，然后GABA通过GABA转氨酶（GABA-T）催化形成琥珀酸半醛（SSA），随后SSA由琥珀酸半醛脱氢酶（SSADH）氧化生成琥珀酸进入柠檬酸循环（TCA循环）[7]。

植物GAD基因于1993年首次由Baum等[8]在矮牵牛中分离定义，随后在很多物种中发现了其同源序列，如拟南芥、水稻、玉米等。不同于动物和细菌中的GAD结构，植物中的GAD通常在C-末端具有一个Ca2+/CaM结合域（CaMBD）。低pH和正常生理条件下CaMBD结合Ca2+/CaM均可导致GABA的富集，因此GAD通过CaMBD结合或缺失Ca2+/CaM进行活性调控，Ca2+/CaM缺失抑制GAD活性，结合Ca2+/CaM则消除抑制作用[9]。拟南芥基因组包括5个编码GAD的基因，其中GAD1、GAD2和GAD4 C-末端包含有CaMBD，而GAD3和GAD5 C-末端不具有CaMBD，其蛋白产物GAD3和GAD5的活性不受Ca2+调控[10]。拟南芥中，GAD1基因主要在根中表达，GAD2基因在所有的器官中均有表达，GAD4和GAD5基因在花中表达，GAD3和GAD4基因在幼嫩的叶片、萼片、心皮及不成熟的果实中有表达[11-14]。

不同的GAD基因在不同的生长时期和生长条件下，其表达水平各不相同。拟南芥中普遍表达的GAD2基因在衰老过程中和高盐条件下表达上调，在缺氧条件下表达下调，而GAD1基因表达水平不受缺氧条件影响。这表明不同的生长条件和胁迫方式对GAD基因的调控不同，如GAD基因在冷胁迫条件下表达上调，在缺氧条件下表达下调[15]。

植物中，GABA最初主要在细胞质中积累，然后转运到线粒体中。GABA的分解代谢为TCA循环和电子传递链提供了底物，因此可以作为有用的代谢底物，在胁迫条件下提供能量和碳架[16]。GABA代谢的关键是通过GABA转氨酶（GABA-T）转化为琥珀酸半醛（SSA）。根据结构的不同，GABA-T可以分为GABA-TK和GABA-TP 2种类型。GABA-TK以α-酮戊二酸为氨基受体生成谷氨酸，GABA-TP以丙酮酸为氨基受体生成丙氨酸，GABA-TP同样具有GABA-TG活性，即以乙醛酸为氨基受体生成甘氨酸[17]。GABA-TK存在于细菌、酵母、真菌、动物中，而GABA-TK和GABA-TP在植物中均有发现，虽然仅分离出了GABA-TP，如番茄中同时存在GABA-TK和GABA-TP[18]。虽然之前的研究表明GABA-TK的活性小于GABA-TP，但Akihiro等[19]研究发现番茄破色期后，GABA-TK的活性显著高于GABA-TP。在番茄果实发育过程中，GABA含量与GABA-TK活性呈显著负相关。在番茄中共分离鉴定出3个GABA-T基因，分别为SlGABA-T1、SlGABA-T2和SlGABA-T3[20]。在拟南芥中只分离出一个GABA-T基因——POP2。

GABA分解代谢的最后一步是SSA通过以NAD+为辅酶的SSA脱氢酶（SSADH）氧化为琥珀酸，进入TCA循环，将GABA支路与呼吸代谢结合起来。SSA同样可以被位于胞浆和叶绿体的SSA还原酶（SSR）还原为γ-羟基丁酸（GHB），也被称为GHB脱氢酶（GHBDH）。SSADH的活性与线粒体内的能量状态相关。在胁迫条件下NAD+∶NADH比值较低，SSADH活性受到抑制，导致SSA累积，进而抑制GABA-T的活性和GABA的分解代謝，促进GABA的累积[21]。胁迫条件能促进SSA还原生成GHB，通过SSA的解毒作用适应胁迫环境。在番茄中共分离出1个SSADH基因（SlSSADH）和2个SSR基因（SlSSR1和SlSSR2）[19]。SlSSADH在番茄果实的整个生育期具有表达，且与GABA含量无相关性。SlSSR1在成熟期的表达水平略高于破色期，而SlSSR2在破色期的表达水平略高[22]。

1.2 多胺降解途径

关于GABA代谢途径的研究主要集中于GABA支路（谷氨酸通路），研究发现，在胁迫条件下，GABA可以通过多胺途径进行合成。如多胺降解途径对于发芽过程中GABA富集的贡献率高达39%[23]。

植物中的多胺主要包括腐胺、精胺和亚精胺。腐胺可以由鸟氨酸通过鸟氨酸脱羧酶（ODC）催化生成，或由精氨酸通过精氨酸脱羧酶（ADC）催化生成。多胺降解主要通过氧化反应，如腐胺通过二胺氧化酶（DAO）催化生成4-氨基丁醛，而精胺和亚精胺则由多胺氧化酶（PAO）催化。4-氨基丁醛通过氨基醛脱氢酶（AMADH）催化生成GABA，在GABA-T和SSADH的催化作用下进入TCA循环，实现GABA的降解代谢[24]。

DAO和PAO均属于胺类氧化酶，其中DAO可以氧化腐胺、精胺和亚精胺，分布于豆科等双子叶植物;PAO可以氧化精胺和亚精胺，分布于禾谷类等单子叶植物[25]。DAO的2个亚基中均含有Cu2+，因此Cu2+处理可导致DAO活性显著提高，而EDTA处理可导致DAO活性的降低，如以EDTA处理豇豆出生叶片，可降低80%的DAO活力[26]。PAO以黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）为辅酶，导致奎叮因可强烈抑制PAO活性。

AMADH属于醛脱氢酶，最早发现于豆科和禾本科，它以NAD+为辅酶，在多胺降解途径中催化4-氨基丁醛脱氢生成GABA[27]。不同物种中AMADH的结构各不相同，如豌豆中的AMADH是230 kDa的四聚体，而燕麦中的AMADH则是55 kDa的单聚体结构，表明AMADH的亚基结构并非其酶活所必须[28-29]。

2 植物富集GABA的方法及作用机理

根据植物中GABA的合成代谢机理，通常通过生物胁迫（染病和虫害）及非生物胁迫（盐、低氧、干旱、热激、冷激等）促进GABA富集。通过籽粒中内源酶激活，提升籽粒的GABA含量及其他营养成分是常用的食品处理方式，主要包括浸泡、发芽及高压、超声、脉冲电场等新型加工方式。通过联合其他的处理同样可以提升GABA含量，如改变浸泡条件，包括添加外源谷氨酸、赤霉素、Ca2+、调节浸泡液pH等。

2.1 盐胁迫

盐胁迫条件下，植物体不但通过增加脯氨酸、有机酸、可溶性糖等多种渗透调节物质的含量，提高SOD、CAT等抗氧化酶的活性以抵抗盐的渗透胁迫，还启动GABA代谢来提高植物体耐盐性。以NaCl对发芽小麦进行盐胁迫处理，发现5个品种小麦的gad基因表达上调，但品种间存在差异，品种Um Qayes 的GAD表达量最多，GABA积累最多[30]。盐胁迫主要通过Ca2+浓度增加，通过调控Ca2+/CaM结合域结合Ca2+，提升GAD活性，进而导致GABA富集。

2.2 低氧胁迫

低氧条件下，植物电子传递链被抑制，TCA循环受到抑制，糖类代谢主要通过糖酵解途径，生成丙氨酸，进而累积乙酸和乳酸，导致细胞质酸化，pH降低，而GABA合成词的关键限速酶GAD在酸性条件下激活，促进了GABA合成。低氧条件下，有氧呼吸作用受到抑制，导致NAD+∶NADH比值较低，SSADH活性受到抑制导致SSA累积，进而抑制GABA-T活性和GABA分解代谢，促进GABA累积。常用的低氧胁迫条件包括浸泡和CO2处理。以20%CO2对采摘后的草莓进行缺氧处理，GAD活性无显著变化，但GABA-T活性显著降低，导致GABA降解代谢率下降，进而实现GABA的富集。对发芽期间的蚕豆进行缺氧处理，结果表明，蚕豆胚中的Glu和多胺含量显著增加，GAD和DAO被激活，GABA 含量达到16 mg/g，是对照组的8.26倍，且多胺降解途径的贡献约为30%[31]。

2.3 温度胁迫

植物体的温度胁迫包括低温胁迫和高温胁迫。低温胁迫包括冷害和冻害，其中冻害会使细胞内产生较大的冰晶体，对细胞膜系统具有显著的损害作用，使Ca2+、H+等深入细胞质激活细胞中的Ca2+/CaM结合域，提高钙调蛋白表达水平，从而激活谷氨酸脱羧酶（GAD）活性催化L-谷氨酸降解形成 GABA，促进 GABA 积累。细胞膜系统的损害同样可以打破区域化的阻碍作用，使谷氨酸和GAD的相互作用更加完善。对萌发大豆进行冻融培养时发现，经过冻融培养的大豆新芽中 GAD、DAO 活性提高，GABA含量增加，达2.34 mg/g，是未进行冻融培养嫩芽的7.21倍[32]。高温胁迫是指环境温度高于植物正常生长温度所造成的一种植物应激现象，主要有短时间处理即热激和长时间处理即干燥。拟南芥突植株在42 ℃热激0.5 h，GABA开始富集，热激2 h，GABA含量得到显著性增加[33]。干燥大豆籽粒經浸泡、冷冻及解冻处理后，GABA含量达1.9 mg/g，较未处理大豆籽粒增加26倍[34]。小麦行粒发芽3 h于120 ℃蒸汽下热激处理30 s 可使其GABA含量提高16.24%[35]。咖啡豆30 ℃干燥至含水量为43%时其GABA含量最高，随后即迅速下降;40 ℃干燥，含水量为39%时，GABA含量最高，40 ℃干燥条件下的最高GABA含量低于30 ℃干燥条件下的最高GABA含量[36]。Suzuki等[37]分别以40 ℃干燥20 h和70 ℃干燥7 h 处理荞麦叶，发现低温长时间干燥的荞麦叶中GABA含量显著高于高温短时间干燥，因此干燥温度和时间对于GABA具有显著影响，在食品加工过程中应提高关注。

2.4 发芽处理

发芽过程是一个典型的生理活化过程。谷物中含有大量的酶，以结合态的方式储存于谷物干谷粒中。在适宜的温度条件下，当谷粒中的水分增加到一定程度时，许多处于休眠状态的酶被激活，由结合态转变成游离态，从而发生酶解作用。发芽过程中，内源酶被激活，物质代谢速率加快，蛋白质水解导致GABA支路的关键反应底物L-谷氨酸含量增加，进而导致GABA富集。

Ohtsubo 等[38]研究发现糙米中GABA含量96 h的发芽过程中不断大幅度上升，GABA 的含量从60.4 mg/kg 上升至1 490 mg/kg。为提升GABA的富集效率，针对GABA合成及降解的代谢机制，通过调节酶活、底物浓度进一步提升GABA含量。Ohtsubo 等[38]发现发芽期间用谷氨酸和壳聚糖混合液浸泡糙米能进一步提高 GABA 的含量，并且发芽后 GABA 含量增加了13倍。

2.5 新型加工方式

高压、脉冲电场、超声波等新型加工方式在不影响原有营养成分、加工特性、结构特点的条件下造成GABA的富集，更符合现代人健康、安全兼具功能性的要求[39]。Kim等[40]通过发芽和高压协同处理，可显著增强糙米GABA的富集，高压发芽2 d（30 MPa，48 h）的种子GABA含量最高，可达1 212.1 mg/kg。Dellarosa等[41]研究发现脉冲电场处理可通过三羧酸循环影响谷氨酸和GABA含量，其中脉冲电场强度为250 V/cm时可显著提高GABA富集量。超声前处理水稻，同样可提升发芽稻米GABA富集水平，GABA含量随处理时间的延长呈现先上升后下降的趋势，15 min达到峰值[42]。高压造成GABA富集的可能机制包括：①通过改变GAD三级结构和构象，提升GAD活性;②GAD结合Ca2+可促进其活性，高压可能通过Ca离子通道的结构改变，提升细胞内Ca2+含量，激活GAD，促进GABA合成;③酸性或高H+浓度条件下，GAD被激活，高压通过细胞器破裂，增强H+释放，降低细胞内pH，提升GAD活性;④高压可以通过激活纤维素酶或机械作用，破坏细胞结构，促进GAD与底物L-谷氨酸之间的相互作用，进而导致GABA富集[39]。超声和脉冲电场虽然可以导致GABA的富集，但其作用机制鲜有涉及。针对超声处理的作用机制，推测主要包括破碎、腐蚀、毛细效应、声孔效应、剪切应力和细胞结构的摧毁。脉冲电场主要是通过其电穿孔效应，影响膜传导作用，增加底物与酶的相互作用，进而促进GABA富集。针对脉冲电场处理因素的设计需综合考虑脉冲强度、脉冲时间及脉冲类型等。

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