液相-原子荧光法测定动物食品中3种有机砷

崔颖，赵良娟，陈文硕，逯玉凤

（1.天津海关动植物与食品检测中心，天津300461；2.北京海光仪器有限公司，北京100015）

阿散酸（arsanilic，ASA）、洛克沙砷（roxarsone，ROX）、硝苯砷酸（nitarsone，NIT）都属于有机砷类制剂，具有刺激动物生长的作用，而且具有较广的抗菌谱，可以改善畜禽的肉质，提高饲料报酬和肉品中色素沉着。虽然有机砷的毒性很小[1]，但大剂量作用时，也会导致中毒，如洛克沙砷可使动物中枢神经系统失调，使脑病和视神经萎缩的发病率提高，因此不能忽视其残留的安全性问题。为此，世界各国都对有机砷制剂作了严格的使用规定，美国食品药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）对动物产品肉和肝、肾脏中的有机砷允许残留限量分别为0.5 mg/kg 和2 mg/kg。而日本的肯定列表中规定：猪肉、猪脂肪、鸡肉、鸡脂肪、家禽蛋中的硝羟苯砷酸允许残留限量为0.5 mg/kg。中华人民共和国农业部第2638 号公告规定，停止在食用动物中使用氨苯砷酸、洛克沙砷等兽药。自2018 年5 月1 日起，停止生产氨苯砷酸、洛克沙砷等兽药的原料药及各种制剂；2019 年5 月1 日起，停止经营、使用氨苯砷酸、洛克沙砷等兽药的原料药及各种制剂。

联用技术结合了色谱的高效分离功能和元素检测器的高选择性，与单一检测技术相比，联用技术的灵敏度、选择性更高，所以联用技术是砷形态分析的重要手段[2]。目前主要的联用技术有高效液相色谱与氢化物发生原子吸收光谱（atomic absorption spectrometry，AAS）、原子荧光光谱 （atomic fluorescence spec trometry，AFS）、电感耦合等离子体发射光谱（inductively coupledplasma-Atomicemissionspectrometry，ICP-AES）、电感耦合等离子体质谱（inductively coupled plasma-Mass spectrometry，ICP-MS）等连用。其中 ICP-MS 有灵敏度高，近几年发展讯速，越来越多将其应用于砷含量测定的报道[3]。Gallard 等[4]把海洋动物肝脏样品冷冻后，用甲醇∶水（9 ∶1）浸提，再用检测各种形态砷含量。Spall 等[5]采用高效液相色谱-电感耦合等离子体发射光谱联用法（high performance liquid chromatography-Inductively coupled plasma-Atomic emission spectrometry，HPLC-ICP-AES）分析生物样品中砷形态的方法，用直线梯度淋洗，分离砷酸根（arsenate，AsⅤ）、亚砷酸根（arsenite，AsⅢ）、一甲基砷（monomethyl arsenic，MMA）和二甲基砷（dimethyl arsenic dimethyl arsenic，DMA）在波长为197.19 nm 处用 ICP-AES 测定，检测限达到60 ng/mL。李卫华等[6]和刘桂华等[7]用HPLCICP-MS 法对我国不同海域海藻的砷形态进行了分析。何小青等[8]用反相离子对HPLC-ICP-MS 成功分离了 AsⅤ、AsⅢ、MMA 和 DMA4 种砷化合物。Fumta 等[9]用IonPac AS 4A-SC 阴离子交换色谱柱-电感耦合等离子体原子发射光谱（ion exchange chromatography-inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry，IC-ICP-AES）测定了不同氧化态的砷，AsⅤ和AsⅢ的检出限分别为70、170 ng/mL。

本试验考虑到液相色谱-电感耦合等离子体/质谱法，仪器价格昂贵，日常运行成本高，该方法较难推广[10]，因此为完善砷元素形态技术，本试验建立了液相色谱-氢化物发生-原子荧光光谱法对动物源食品样品中阿散酸、洛克沙砷、硝苯砷酸残留量同时测定的方法，保障了我国食品安全，具有很强的应用前景和潜在的社会效益。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

由1260 型号高效液相色谱仪：美国Agilent 公司，包括液相色谱泵和进样装置；9560 型原子荧光光谱仪：北京海光公司；T18 组织匀浆机：德国IKA 公司；LD4-2 型冷冻离心机：北京医用离心机厂；Milli-Q Reference 型超纯水仪：德国Millipore 公司。

甲醇溶液（HPLC 级）：德国 Merck 公司；三氟乙酸（分析纯）：上海天莲精细化工有限公司；阿散酸（p-Arsanilic acid，ASA，CAS 编号：2045-00-3，C6H8AsNO3，纯度≥99%）；洛克沙砷（3-Nitro-4-hydroxy-phenylarsonic acid，ROX，CAS 编号：121-19-7，C6H6AsNO6，纯度≥97.5 %）；硝苯砷酸（4-Nitrophenylarsonic acid，NIT，CAS 编号：98-72-6，C6H6AsNO5，纯度≥95%）。

标准储备液：分别准确称取适量的阿散酸、洛克沙砷、硝苯砷酸标准品，用去离子水分别配成浓度为500 μg/mL 的阿散酸、洛克沙砷、硝苯砷酸标准储备液。根据需要用去离子水稀释成适当浓度的标准工作液。在0 ℃～4 ℃冰箱中保存，有效期为6 个月。

鸡肉、鸡肝、鸡肾、鸡可、猪肉、猪肝、猪肾：市售。将样品用绞肉机绞碎，混匀，均分成两份试样，分装入洁净的盛样袋内， 密闭并标明标记，于-18 ℃以下冷冻保存。

1.2 液相色谱和原子荧光光谱条件

1.2.1 液相色谱参考条件

色谱柱：Luna C18 柱（5 μm，250 mm×4.60 mm）；流动相：甲醇-三氟乙酸（0.1 %）-磷酸二氢钾溶液（10.2.4）（5 ∶95，体积比）；流速：1.2 mL/min；进样体积：100 μL。

1.2.2 原子荧光检测参考条件

负高压：330 V；灯电流：100 mA；载气流量：400 mL/min；屏蔽气流量：900 mL/min；盐酸溶液流速：120 r/min；硼氢化钾流速：120 r/min；过硫酸钾溶液流速：110 r/min；读数模式：峰面积。

1.3 测定方法

称取1 g（精确到0.001 g）试样于50 mL 离心管中，加 10 mL 甲醇-水提取液（1 ∶1，体积比），水浴振荡萃取120 min，10 000 r/min 离心5 min，将上清液转移至25 mL 容量瓶中。残渣再加5mL 提取液25 mL 容量瓶中。重复“残渣再加5 mL 提取液，在涡旋混合器上充分混合，10 000 r/min 离心5 min，将上清液转移至25 mL 容量瓶中”操作一次。合并上清液于25 mL 容量瓶中，定容。取4 mL 上清液，氮气吹扫，用提取液定容至2 mL，经0.45 μm 有机滤膜过滤后进行测定。按同一操作方法作空白试验。

分别准确吸取1.00 mg/L 硝苯砷酸标准工作液和1.00 mg/L 洛克沙砷标准工作液 0.00、0.40、0.60、0.80、1.00 mL 和1.20 mL，及1.00 mg/L 阿散酸标准工作液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80 mL 和 1.00 mL 于 6 个 10 mL容量瓶，用水稀释至刻度，此混合标准系列溶液的阿散酸浓度为 0.0、20.0、40.0、60.0、80.0 μg/L 和 100.0 μg/L，硝苯砷酸和洛克沙砷浓度均为 0.0、40.0、60.0、80.0、100.0 μg/L 和120.0 μg/L。测定标准系列溶液得到色谱图，以保留时间定性，以标准系列溶液中目标化合物的浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

2 结果与分析

2.1 试验条件的优化

2.1.1 流动相浓度的优化

本部分主要分析了流动相浓度对有机砷形态分离的影响。在反相色谱分离中，向流动相添加乙酸、三氟乙酸或甲酸等酸性缓冲液或者是添加磷酸氢二钠、磷酸二氢钾或磷酸氢铵等缓冲盐，有助于改善色谱峰形并且提高色谱峰的分离度。本试验选择甲醇和含1 %三氟乙酸的0.05 mol/L 磷酸二氢钾溶液作为流动相，以100 μg/L 的有机砷形态混合标准溶液为测试对象，结果见图1。

图1 液相色谱-原子荧光光谱图Fig.1 LC-AFS chromatogram

图1 发现：当流动相中甲醇与0.1%三氟乙酸的0.05 mol/L 磷酸二氢钾溶液体积比为5 ∶95 时，阿散酸、洛克沙砷、硝苯砷酸均能在20 min 内出峰且峰形良好，有极佳的灵敏度。

试验考察了甲醇和含0.1%三氟乙酸的0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液不同体积比对各有机砷形态保留时间的影响，甲醇和含0.1%三氟乙酸的0.05 mol/L 磷酸二氢钾溶液的体积比分别是：5 ∶95、10 ∶90、15 ∶85、20 ∶80，结果见图2。

图2 不同浓度流动相对应3 种砷形态的峰面积Fig.2 Peak area of three arsenic speciations corresponding to different concentration mobile phases

如图2 所示：当增加甲醇的体积时，各砷形态的相对峰面积也降低，这是由于甲醇会对原子荧光检测器有荧光猝灭效应。因此，综合考虑以上因素，优化后的流动相组成为体积比5 ∶95 的甲醇和含0.1%三氟乙酸的0.05 mol/L 磷酸二氢钾溶液。

2.1.2 流动相流速的选择

流动相流速对液相色谱来说，流动相的流速越小，理论塔板高度（H）值也越小，柱效率就越高，但很难找出H 的极小值，因为在很小的流速下，分子扩散也不明显，对H 值没有明显影响，可以使用较高的流速，柱效损失不大，有利于实现快速分离。较好的分离度与分析时间有关。试验考察了不同的流动相流速对3 种有机砷形态保留时间的影响，流动相流速分别为1.0、1.1、1.2 mL/min，结果见图 3。

图3 不同的流动相流速对应3 种砷形态的保留时间Fig.3 Retention time of three arsenic speciations corresponding to different flow velocities of mobile phase

试验结果如图3 显示：流速越快，峰的保留时间越短。本试验在分离度足够时选择保留时间短的流速，最终选择的流动相流速为1.20 mL/min。

2.1.3 氧化剂浓度的优化

有机砷经色谱分离后进入在线紫外氧化消解，将有机砷转化成无机砷进行测定。通过在线紫外氧化消解，提高了有机砷转化成无机砷的效率，提高了灵敏度，色谱峰的拖尾现象能明显得到改善。本方法以100 μg/L 的有机砷形态混合标准溶液的试验结果为依据来优化，选择过硫酸钾作为氧化剂。试验考察了不同浓度氧化剂对3 种有机砷形态峰面积的影响，结果见图4。

图4 过硫酸钾浓度对峰面积的影响Fig.4 Effect of potassium persulfate concentration on peak area

由图4 可知：当过硫酸钾浓度为3%时，峰面积最大，灵敏度最高，此后趋于稳定。最终选定氧化剂过硫酸钾浓度为3%。

2.1.4 氢化物发生条件的优化

2.1.4.1 还原剂流速的优化

试验反应所需的载流盐酸溶液和硼氢化钾溶液是通过蠕动泵传输到氢化物发生装置的，蠕动泵最大泵速为120 r/min。为了在氢化物发生过程中得到最大的灵敏度，在相同的液相色谱分离条件下，以100 μg/L的有机砷形态混合标准溶液的试验结果为依据来优化硼氢化钾的流速。试验考察了硼氢化钾流速对3 种有机砷形态峰面积的影响，在盐酸流速为120 r/min、浓度为5%，硼氢化钾浓度为20.0 g/L 条件下，做了还原剂不同流速对比试验，流速分别设为70、80、90、100、110 和 120 r/min，结果见图5。

图5 不同的还原剂流速对应3 种砷形态的峰面积Fig.5 Peak area of three arsenic speciations corresponding to different flow velocities of reductant

如图5 显示：随着还原剂硼氢化钾流速的增大，3种砷形态的峰面积也相应增强。为了使3 种砷形态有最佳的灵敏度，标准设还原剂流速为120 r/min。

2.1.4.2 浓度的优化

在硼氢化钾浓度为20.0 g/L 条件下，研究了盐酸浓度为：2、5、8、10%（体积分数）对砷形态氢化物发生的影响见图6；在盐酸浓度为5%时，研究了还原剂浓度为：10、15、20、25、30 g/L 对砷形态氢化物发生的影响见图7。

图6 盐酸浓度对砷形态氢化物发生的影响Fig.6 Effect of HCl concentration on the formation of arsenic hydride

图7 硼氢化钾浓度对砷形态氢化物发生的影响Fig.7 Effect of potassium borohydride concentration on the formation of arsenic hydride

由图6 可知：当盐酸浓度较低时，各有机砷形态的峰面积随着盐酸浓度的增大而增强，当盐酸浓度为5%时，各有机砷形态有最佳的峰面积响应，之后随着盐酸浓度的增大各有机砷形态的峰面积先降低而后又缓慢上升，所以盐酸的浓度设为5%。由图7 可知：当硼氢化钾的浓度为20.0 g/L 时3 种砷形态都可以得到较高的峰面积响应。这是因为当硼氢化钾浓度较小时导致氢化反应不完全，而当硼氢化钾浓度较高时却又产生了过多的氢气，导致样品的气态氢化物浓度被稀释了，从而灵敏度也跟着下降了。所以优化后，盐酸的浓度设定为5%，硼氢化钾的浓度设定为20.0 g/L。

2.1.5 提取溶剂的选择

有机物的提取剂一般选择丙酮-水溶液、乙醇-水溶液、甲醇-水溶液。试验选择了3 种提取溶剂：丙酮-水溶液（1 ∶1，体积比），乙醇-水溶液（1 ∶1，体积比）和甲醇-水溶液（1 ∶1，体积比），微波辅助萃取条件参考仪器条件。试验对3 种提取溶剂的提取效率进行研究，考察指标为加标100 μg/L 的猪肝样品的加标回收率，结果见图8。

图8 甲醇-水溶液、丙酮-水溶液和乙醇-水溶液3 种提取溶剂的提取效率Fig.8 Different extraction efficiencies of Methanol-water solution，Acetone-water solution and Ethanol-water solution

结果如图8 显示：甲醇-水的提取效率最高，丙酮-水的提取效率次之，用乙醇-水做提取溶剂提取效率最低。从试验提取液可以看出，乙醇-水溶液容易将动物源性食品中的可溶性有机物提取出来，提取液中溶解的有机物增多了不仅使提取液颜色变深而且液体变得黏稠，因此导致萃取不完全，不利于各有机砷形态充分提取，从而影响试验结果的正确测定。丙酮由于极性大、穿透力强，对有机砷有较好的提取效果，但是猪肝样品中含有较高的脂肪，而丙酮容易将大量的脂肪提取出来，这样不利于后面提取液的浓缩和净化。因此，提取溶剂最终选择甲醇-水溶液。

2.1.6 提取剂比例的优化

由于动物源性食品中的可溶性有机物也能部分溶于甲醇中，为减少溶解的可溶性有机物对提取效率的影响，对甲醇-水溶液的比例进行优化。试验用体积比为 1 ∶9、2 ∶8、3 ∶7、4 ∶6、5 ∶5、6 ∶4、7 ∶3 的甲醇-水溶液对加标100 μg/L 的猪肝样品进行提取，考察了不同甲醇溶液浓度对提取率的影响，结果见图9。

图9 甲醇溶液浓度对提取率的影响Fig.9 Effect of methanol solution concentration on extraction rate

结果如图9 看出：在甲醇比例较小时，样品提取效率随着甲醇比例的增大而提高，甲醇+水（1 ∶1，体积比）提取效率明显高于甲醇+水（4 ∶6，体积比），但是当甲醇比例增大到一定程度时，样品提取效率却随着甲醇-水体积比的增大而降低，甲醇+水（6 ∶4，体积比）提取效率低于甲醇+水（1 ∶1，体积比）。适量的甲醇有助于提高有机砷的提取效率，但过多的甲醇会提取出样品中的可溶性有机物质，从而降低了样品的提取效率。因此，选择体积比1 ∶1 的甲醇-水溶液作为提取溶剂。

2.2 检测低限、线性范围及相关系数

采用标准溶液逐步稀释法测定信噪比大于3 ∶1时，样品中阿散酸、洛克沙砷、硝苯砷酸的检测低限。分别配制含阿散酸质量浓度为 0.0、20.0、40.0、60.0、80.0 μg/L 和 100.0 μg/L（相当于样品 0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/kg）、含硝苯砷酸和洛克沙砷质量浓度均为0.0、40.0、60.0、80.0、100.0 μg/L 和 120.0 μg/L 的混合标准溶液（相当于样品 0.0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/kg），进样量为100 μL，在选定的色谱条件下进行测定，用峰面积对混合标准溶液中各组分的浓度做图，其检测低限、线性方程和线性相关系数见表1。

如表1 所示：在 0～120 μg/L 范围内阿散酸、洛克沙砷、硝苯砷酸的线性关系良好，线性相关系数均大于0.999。

表1 阿散酸、洛克沙砷、硝苯砷酸的线性范围、线性方程和相关系数Table 1 The analytical parameters of ASA，ROX and NIT（n=6）

2.3 样品分析

按照试验方法对鸡肉、鸡肝、鸡肾、猪肉、猪肝、猪肾6 种市售样品，在3 个添加水平上进行添加回收率试验，每个水平重复做6 次，回收率和精密度结果见表 2。ASA 添加水平为 0.1 mg/kg～0.5 mg/kg，NIT 和ROX 的添加水平均为0.2 mg/kg～2.0 mg/kg。鸡肉样品中添加 ASA 为 0.1mg/kg，NIT 和 ROX 为 0.2 mg/kg 的液相色谱图见图10。

表2 样品中阿散酸、洛克沙砷、硝苯砷酸的添加回收率及精密度试验数据（n=6）Table 2 Recovery of three concentration in samples（n=6）

图10 鸡肉样品加标色谱图Fig.10 Chromatogram of ASA，ROX and NIT from spiked chicken samples

如表2 所示，6 种市售样品中3 个添加水平的平均回收率为阿散酸81.0%～102.5%，洛克沙砷80.0%～104.9%，硝苯砷酸81.0%～101.8%；相应的RSD 分别为1.61%～6.95%、1.32%～7.52%、0.97%～8.12%。如图10 所示：阿散酸、洛克沙砷、硝苯砷酸检测低限分别为 0.1、0.2、0.2 mg/kg。

3 结论

本文介绍了采用液相色谱-氢化物发生-原子荧光光谱法同时测定动物源性食品中阿散酸、洛克沙砷、硝苯砷酸3 种有机砷残留量，探讨了试验条件的优化和实验方法的验证。其中，试验条件优化包括流动相的选择、浓度和流速，氧化剂浓度，还原剂浓度和流速，以及提取剂的选择和浓度比例。实验方法的验证包括方法的检测低限和标准曲线。最终确立试验优化结果为：高效液相色谱流动相为5 ∶95 的甲醇和含0.1%三氟乙酸的0.05 mol/L 磷酸二氢钾溶液，液相高压泵泵速为1.20 mL/min；氧化剂过硫酸钾浓度为3 %；氢化物发生装置的载流盐酸的浓度为5%，还原剂硼氢化钾的浓度为20.0 g/L，流速为120 r/min；提取试剂为体积比1 ∶1 的甲醇-水溶液。验证结果表明本方法具有良好的回收率，并且方法稳定性高、重复性好，多次试验结果的RSD 均小于10%，能够满足日常检测工作的需要。