无溶剂体系微波辅助脂肪酶催化合成玉米淀粉酯

马惠琳，辛嘉英，2，*，郑丽娜，王艳，崔添玉

（1.哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江哈尔滨150010；2.中国科学院兰州化学物理研究所羰基合成与选择氧化国家重点实验室，甘肃兰州730000）

天然淀粉来源广泛，因其具有无毒性、可再生、可生物降解和可改性的特性广泛应用于食品工业、药用辅料和添加剂、纺织品、纸张和包装材料等领域[1-3]。但由于天然淀粉亲水性强、脆性高、加工性差、在普通有机溶剂中不易溶解，这在一定程度上限制了它的进一步应用。故天然淀粉的改性研究非常有意义。与传统淀粉相比，改性淀粉的性质可以发生显著改变，从而增加其功能[4-8]。

酯化是对淀粉进行改性的常用手段之一[9-11]。其主要目的是将这种具有结晶性和脆性的材料改性为新的聚合物材料，使这种新材料不溶于水并且具有更高的拉伸强度和增强功能。化学法合成淀粉酯已经被广泛报道[12-15]。淀粉酯也可以通过酶法合成。酶法合成具有多优点，包括立体选择性、区域选择性和化学选择性。这种高选择性可以给化学合成提供一些便利，例如减少或消除保护基团、减少副反应、更容易分离和减少环境问题。其他优点如在商业应用中的高催化效率也非常有吸引力[16]。

课题组前期使用脂肪酸作为底物进行淀粉酯[17-20]时底物脂肪酸必须首先通过甘油三酯酯水解步骤获得后才能进行淀粉酯合成。本研究直接选用脂肪酸甘油酯作为酰基供体可以省去水解反应步骤，通过预处理后的玉米淀粉和筛选出的酰基供体为底物，在无溶剂系统中利用微波辅助脂肪酶催化底物直接进行酯交换反应，一步合成了脂肪酸淀粉酯，从而创造一种制备酯化改性淀粉的新方法，用于生产纯天然绿色的脂肪酸淀粉酯。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米淀粉、糖化酶（100 000 U/g）、α-淀粉酶（3 700 U/g）：苏州畅通化学有限公司；固定化南极假丝酵母脂肪酶（Novozym 435，10 000 U/g）：丹麦Novozymes A/S 公司；猪胰脂肪酶（porcine pancreas lipase，PPL，90 U/g）、固定化嗜热真菌脂肪酶 （lipozyme TLIM，TLIM，100 U/g）：美国 Sigma 公司；三油酸甘油酯：国药集团化学试剂有限公司；三软脂酸甘油酯：成都艾科达化学试剂有限公司；三硬脂酸甘油酯、3Å 分子筛：天津光复精细化工研究所；所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

超声波细胞破碎仪（SCIENTZ-ⅡD）：宁波新芝生物科技股份有限公司；EMS-8C 型恒温磁力搅拌器：天津欧诺仪器仪表有限公司；JJ-1 型精密定式电动搅拌器：江苏荣华仪器制造有限公司；XH-100 型微波催化合成/萃取仪：北京祥鹄科技发展有限公司；DHG-9053A型电热恒温干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司。

1.3 淀粉预处理方法筛选

将玉米淀粉使用不同方法进行预处理操作，再用处理后的淀粉制备脂肪酸淀粉酯，以产物取代度为指标筛选出最优预处理方法，后续试验操作使用的淀粉均先用最优方法处理。

1.3.1 酶解法（enzymatic method，ES）

称取15 g 玉米淀粉与100 mL、pH 4.6 的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液混匀，45 ℃水浴预热后向淀粉悬浮液中加入适量用缓冲溶液配制的淀粉酶液（糖化酶∶α-淀粉酶=3 ∶1，质量比），42 ℃搅拌反应 24 h 后，用4%的氢氧化钠5 mL 停止反应。淀粉悬浮液5 000 r/min离心5 min，去离子水洗涤剩余淀粉后离心，此过程循环多次后将得到的淀粉于50 ℃下烘干至恒重，研磨过筛后得到预处理淀粉[21]。

1.3.2 化学法（chemical method，CS）

将 NaOH、尿素按 2 ∶1（质量比）用 100 mL 蒸馏水中配成混合水溶液，先预冷至一定温度，向其中缓慢加入5 g 玉米淀粉快速搅拌制得均匀的淀粉糊。滴加稀盐酸至淀粉糊呈中性，再缓慢滴加无水乙醇使淀粉沉淀析出。将淀粉悬浮液用95%乙醇溶液抽真空洗涤数次，再用无水乙醇洗涤后烘干至恒重，研磨过筛后得到预处理淀粉[22]。

1.3.3 预糊化法（pregelatinization method，GS）

配制质量分数为5%的淀粉糊置于60 ℃的恒温水浴中糊化30 min，糊化后于50 ℃真空干燥得到预处理淀粉。

1.3.4 超声法（ultrasonic method，US）

10 g 玉米淀粉和40 mL 无水乙醇常温搅拌均匀，在超声功率50 W 下处理30 min，用80%乙醇溶液洗涤淀粉后抽滤后烘干至恒重，研磨过筛后得到预处理淀粉。

1.4 脂肪酶种类的筛选

酰基供体选用三油酸甘油酯（triolein，GTO），以产物取代度为指标研究在淀粉2 g，GTO 15 g，脂肪酶4%，微波功率700 W，温度60 ℃，200 r/min 搅拌，反应时间2 h 条件下，固定化南极假丝酵母脂肪酶（N435）、猪胰脂肪酶（PPL）、固定化嗜热真菌脂肪酶（TLIM）3 种脂肪酶对脂肪酸酯合成的影响。筛选最适脂肪酶用于后续试验。

1.5 酰基供体的筛选

以产物取代度为指标研究在淀粉2 g，酰基供体15 g，脂肪酶 4%，微波功率 700 W，温度 60 ℃，200 r/min搅拌，反应时间2 h 条件下，三软脂酸甘油酯（tripalmitin，GTP）、三硬脂酸甘油酯（tristearin，GTS）、GTO对脂肪酸酯合成的影响。筛选最适酰基供体用于后续试验。

1.6 微波辅助酶促脂肪酸淀粉酯的合成

在无溶剂的反应体系中，将预处理后的淀粉2 g与三脂肪酸甘油酯15 g 混合均匀，加入一定量N435 脂肪酶，2 g 分子筛，微波功率700 W，搅拌速度200 r/min，在一定温度条件下反应一段时间。

停止反应时向反应体系中加入25 mL 无水乙醇，充分搅拌后静止10 min，50 mL 的65 ℃热无水乙醇洗涤抽滤，重复3 次，产物过80 目筛除去脂肪酶。50 ℃干燥备用。

1.7 脂肪酶活力测定

采用橄榄油乳化法测定并计算脂肪酶活力[23]。

式中：V 为样品所消耗碱得体积，mL；V0为空白样品所消耗碱的体积，mL；t 为反应时间，min；n 为稀释倍数。

1.8 脂肪酸淀粉酯取代度的测定

取代度参考文献采用气相色谱法测量[22]。取代度测定所使用的气相色谱条件如下：色谱柱：DM-FFAP石英毛细管柱，30 mm×0.32 mm×0.25 μm；柱温：220 ℃，进样口温度：250 ℃，检测器温度：260 ℃。载气：高纯氮；柱流速：2.0 mL/min；尾吹流速：40 mL/min；氢气流速：35 mL/min；空气流速：350 mL/min；分流比 50 ∶1；进样量1 μL。计算取代度。

取代度=（n×M1）/（M0-n×M2+n×MH2O）

式中：n 为产物脂肪酸淀粉酯中脂肪酸的物质的量，mol；M0为样品质量，g；M1为葡萄糖残基的分子量；M2为脂肪酸的分子量；MH2O为水的分子量。

1.9 淀粉酯合成的单因素试验

对脂肪酸淀粉酯的合成进行工艺优化，选择反应时间、反应温度、酰基供体添加量和酶添加量4 个因素进行单因素试验。优化条件分别为：淀粉添加量2 g，N435 脂肪酶添加量4%，GTO 添加量15 g，分子筛2 g，微波功率700 W，200 r/min 搅拌，反应时间2 h 条件下研究温度在 55、60、65、70、75 ℃时对产物取代度的影响；不改变其他条件，在最适温度下研究研究反应时间分别为 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h 时对产物取代度的影响；不改变其他条件，在最适温度和最适时间条件下研究 GTO 添加量分别为 5、10、15、20、25 g 时对产物取代度的影响；不改变其他条件，在最适温度、时间和GTO 添加量条件下研究酶添加量分别为3 %、4 %、5 %、6%、7%时对产物取代度的影响。

1.10 淀粉酯合成的条件优化

在单因素试验的基础上，选择反应时间、反应温度、GTO 添加量、酶添加量4 个因素，每个因素根据结果选取较优的3 个水平，安排L9（34）正交试验见表1，以脂肪酸淀粉酯的取代度作为指标。

表1 正交试验设计因素与水平Table 1 Factor and level of independent variables used for orthogonal test

2 结果与分析

2.1 淀粉预处理方法筛选

淀粉预处理方法对产物取代度的影响见图1。

图1 淀粉预处理方法对产物取代度的影响Fig.1 Effect of pretreatment method of starch on the substitution degree of product

如图1 所示，与不处理淀粉（NS）直接参与反应相比，各种预处理方法均可以使淀粉的取代度有不同程度的升高，其中超声波法预处理（US）淀粉取代度最大。这是由于预处理后淀粉颗粒结构被破坏后比表面积增大，酶催化作用所需的接触面积也相应扩大。由于超声波法预处理底物取代度最高，因此淀粉的预处理方法选择超声法。

2.2 脂肪酶筛选

不同种类的脂肪酶参与酯化反应中酶活力及对脂肪酸淀粉酯的影响见图2。

由图2（a）可知N435 脂肪酶的酶活最高，但脂肪酶的活力只能证明发生了反应而不能确定产物的量。所以进一步比较了不同种类的脂肪酶对产物取代度的影响。结果如图2（b）所示，N435 脂肪酶催化酯化反应的产物取代度远高于另外两种脂肪酶，因此后续试验选用N435 脂肪酶作为催化剂。

2.3 酰基供体对产物取代度的影响

不同酰基供体对脂肪酸淀粉酯的影响见图3。

图2 脂肪酶种类对产物取代度的影响Fig.2 Effect of the varieties of lipases on the substitution degree of product

图3 酰基供体种类对产物取代度的影响Fig.3 Effect of the varieties of acyl donor on the substitution degree of product

由图3 可知，其中三油酸甘油酯能取得更高的取代度，三硬脂酸甘油酯取代度则最小。这是因为三油酸甘油酯中碳碳双键的存在使分子内羧酸脂肪链之间不能紧密接触，导致油脂分子之间不能紧密接触，分子间作用力减少，熔点降低，且三油酸甘油酯黏度更小，转酯反应更快。通过酰基供体的选择，确定了GTO 为后续试验的反应底物。

2.4 温度对产物取代度的影响

温度对产物取代度的影响见图4。

图4 温度对产物取代度的影响Fig.4 Effect of temperature on the substitution degree of product

如图4 所示，反应温度低于65 ℃时随着反应体系中温度不断升高，取代度随温度升高而逐渐增加，65 ℃时达到最大，继续升高温度后取代度随温度升高而降低。这可能是因为反应温度的上升加剧了酶与底物之间的相互碰撞，促使反应向有利于脂肪酸淀粉酯合成的方向进行。继续升温后过高的反应温度可能会影响酶的稳定性，降低酶活性使反应速率降低。因此，反应条件以65 ℃为宜。

2.5 时间对产物取代度的影响

反应时间对产物取代度的影响见图5。

图5 反应时间对产物取代度的影响Fig.5 Effect of reaction time on the substitution degree of product

如图5 所示，反应时间在1.5 h 以内时，取代度随时间增加而逐渐增大，1.5 h 时产物取代度达到最大值，此时反应体系中主要进行有利于产物合成的转酯反应，产物脂肪酸淀粉酯逐渐积累，反应不断向正向进行。后随着反应时间的延长，取代度呈现出减小趋势，出现这种情况可能是由于转酯反应逐渐趋于平稳后，产物积累的同时有副产物水生成，脂肪酸淀粉酯可能发生水解反应，随时间增加产物不断被消耗，造成产物取代度下降。因此，反应时间以1.5 h 为宜。

2.6 GTO添加量对产物取代度的影响

GTO 添加量对产物取代度的影响见图6。

图6 GTO 添加量对产物取代度的影响Fig.6 Effect of GTO added amount on the substitution degree of product

如图6 所示，GTO 添加量小于20 g 时，取代度随GTO 含量增加而增大，GTO 添加量20 g 时取代度达到最大，此后在增加GTO 添加量取代度则开始下降。这可能是因为酰基供体的含量的增加使反应向着有利于脂肪酸甘油酯合成的方向进行。当添加量超过20 g时取代度降低可能是因为反应体系的黏度增大，流动性降低，影响了底物与酶催化活性中心的接触[15]，降使取代度减小。因此，反应条件以GTO 添加量20 g 为宜。

2.7 酶添加量对产物取代度的影响

酶添加量对产物取代度的影响见图7。

图7 酶添加量对产物取代度的影响Fig.7 Effect of lipase added amount on the substitution degree of product

如图7 所示，酶添加量在5%以内时，取代度随着酶含量的增加逐渐增大，添加量为5%时取代度达到最大值，继续增加酶取代度则基本不变。这可能是因为反应体系中的酶与底物的接触更充分，使反应向着有利于脂肪酸甘油酯合成的方向进行，所以取代度更高，继续增加酶含量取代度不再增加甚至略有下降，可能是过多的酶发生团聚影响了与底物的反应。因此，反应条件以酶添加量5%为宜。

2.8 正交试验法确定微波辐射催化酶合成脂肪酸淀粉酯最优条件

各因素之间存在的复杂的交互作用会影响酶合成脂肪酸淀粉酯。为了优化合成条件，在单因素基础上采用L9（34）正交试验研究反应时间、反应温度、GTO添加量、酶添加量4 个因素对脂肪酸淀粉酯的取代度的影响见表2。

表2 正交试验表Table 2 Orthogonal test table

由表2 可以得出影响脂肪酸玉米淀粉酯取代度的主次因素顺序为：反应温度＞反应时间＞酶添加量＞GTO 添加量。采用L9（34）正交试验分析得出微波辐射酶促脂肪酸淀粉酯合成的最佳反应条件为：反应温度为 60 ℃，反应时间为 2.0 h，GTO 添加量为 20 g，酶添加量5%，在该反应条件下的取代度为0.034 6。

3 结论

本文对催化合成脂肪酸酯反应的淀粉的预处理方法、酶种类和酰基供体种类进行筛选，确定超声波处理为最佳的底物处理方法，N435 脂肪酶作为生物催化剂，三油酸甘油酯为反应的酰基供体。对反应体系进行了条件优化，研究了反应时间、反应温度、三油酸甘油酯添加量和酶添加量等因素的影响，得出酶添加量 5%，反应时间 2.0 h，GTO 添加量 20 g，温度 60 ℃为最佳反应条件。在最佳反应条件下得到最终产品的取代度为0.034 6。