响应面法超声辅助提取香椿叶总黄酮及抑菌效果研究

宋怡伟，赵志刚，韩成云，*

（1.宜春学院化学与生物工程学院，江西宜春336000；2.宜春学院生命科学与资源环境学院，江西宜春336000）

香椿（Toona sinensis）为双子叶植物纲芸香目楝科植物[1]，全株具有浓烈的特殊性气味且富含多种活性物质（黄酮类、酚类及其衍生物、萜类、皂苷类、以及挥发油等）[2]。它的根、皮、茎叶、果实都可入药，药用价值很高。香椿含钙、磷、钾、钠和微量元素等成分，有补虚壮阳、补肾养发、消炎止血、行气健胃等作用。因此肾阳虚衰、腰膝酸软、遗精阳痿、易脱发、食欲不佳者宜食之。黄酮广泛存在于各种植物中，其中香椿叶主要有效成分之一就是黄酮，研究表明黄酮对心血管疾病有一定预防作用[3]，对肿瘤也有一定的抑制作用[4]；黄酮还可用于保肝，可以用来治疗肝炎，肝硬化等[5]。黄酮对抑制真菌、细菌也有一定的积极作用[6]。在香椿叶中含有的黄酮类物质具有药用与保健价值，受到专家学者的广泛的关注。因此，对于香椿叶黄酮类物质的相关研究具有重要意义与广阔的前景[7]。

超声波辅助提取法能增加所提取的化合物的含量[8]。其原理主要是通过破坏细胞壁，使得目标提取物更好的溶于溶剂中来实现提取有效成分[9-10]。响应面法分析在提取试验中往往能够得到一个试验的最优工艺参数[11]，通常用来解决多因素影响的优化问题[12]。

研究通过对芦丁对照品的标准曲线测定香椿叶中总黄酮的含量，采用响应面分析法对影响香椿叶总黄酮提取率的三因素（液料比、乙醇浓度和提取时间）进行分析，确定最优的提取工艺，再将香椿叶总黄酮提取液对3 种细菌（大肠杆菌、枯草芽孢杆菌以及金黄色葡萄球菌）采用管碟法开展抑菌试验研究，研究结果对于香椿叶总黄酮成分的开发具有一定的借鉴意义。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

新鲜香椿嫩叶：江西隆平有机农业有限公司，采摘时间不超过24 h，经过低温烘干，用粉碎机粉碎，粉碎后过100 目筛，放于4 ℃冰箱备用；大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）：上海鲁微科技有限公司；芦丁对照品（纯度≥98%）：上海圻明生物科技有限公司；亚硝酸钠：江苏永华化学科技有限公司；氢氧化钠、硝酸铝：国药集团化学试剂有限公司；乙醇：天津市大茂化学试剂厂。试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器

主要仪器设备见表1。

表1 主要试验仪器设备Table 1 Main experimental equipment

2 试验方法

2.1 单因素及响应面试验设计

参考其他[13-15]研究，选取液料比 10 ∶1（mL/mg）～50 ∶1（mL/mg），提取时间 20 min～60 min，乙醇浓度50 %～90%进行单因素试验，再对三因素做响应面分析试验，设计方案见表2，确定提取的最佳条件。

表2 响应面设计方案Table 2 Response surface design scheme

2.2 香椿叶总黄酮含量的测定

2.2.1 芦丁标准曲线的制作

精确称量10 mg 芦丁，用70%的乙醇溶解并定容至50 mL，得到芦丁对照品。分别移取0、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mL 芦丁对照品于试管中；在各试管中分别加入5 %亚硝酸钠0.30 mL，振荡后静置6 min；再分别加入10 %硝酸铝0.30 mL，振荡后静置6 min；分别加入4%的氢氧化钠，并用60%的乙醇定容至10 mL，振荡后静置16 min；再分别取试管中的溶液于1 cm 的比色皿中置于分光光度计，检测波长510 nm的吸光度，记录各个值[16]。选取芦丁浓度（mg/mL）为X轴，吸光度做Y 轴，见图1。

得到回归方程y=13.167x+0.026 43，其中R2=0.99109。结果显示0 mg/mL～0.06 mg/mL 存在较好的线性关系。

2.2.2 香椿叶总黄酮含量的测定

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Standard curve of rutin

取 5 份香椿叶干燥粉末（1.00 g），在 100 mL 的三角瓶中分别加入香椿叶干燥粉末和不同浓度的乙醇，振荡摇匀。用超声波（功率为500 W，提取温度为60 ℃）在不同时间段进行总黄酮的提取。过滤，加同等体积的无水乙醇沉淀一晚，过滤，再浓缩。依据芦丁标准曲线测定香椿中总黄酮的含量，然后选取适宜液料比、乙醇浓度和提取时间进行响应面分析。

2.3 抑菌试验

将3 种供试菌活化，挑取单菌落放于装有2 mL 生理盐水的离心管中制备菌悬液[17]。无菌条件下，移取100 μL 菌悬液于LB 固体培养基上，涂布均匀，每种菌各9 个板，每个板上等距放置4 个牛津杯，静置10 min。

准确称取香椿叶粉末10.00 g，加入70 %乙醇300 mL，超声波清洗仪中超声提取40 min，提取后过滤、浓缩至20 mL，离心，即得到香椿叶乙醇粗提物。用微孔滤膜（0.22 μm）过滤，待用。

以香椿叶乙醇粗提物原液为基础，稀释为3 个浓度梯度：提取原液、50%和25%香椿叶粗提物。同时也将溶剂对照组稀释为同样的浓度，观察不同浓度提取液的抑菌情况[18]。

移取100 μL 各浓度提取液注入3 个牛津杯内，剩余一个为对照组，所有培养皿按此操作，每种供试菌各浓度梯度都进行3 次平行试验。然后置于细菌培养箱内37 ℃条件下培养24 h，之后观察抑菌圈大小。

3 结果与分析

3.1 单因素试验分析

3.1.1 液料比对提取率的影响

液料比对提取率的影响见图2。在确定的因素下（超声功率500 W，提取温度60 ℃，提取时间40 min，提取溶剂为70%乙醇），液料比与总黄酮含量呈正相关，这可能是因为溶剂增多目标提取物的溶出量也有所提高[19]。但当液料比超过 30 ∶1（mL/mg）后总黄酮提取含量趋于平缓，通过对不同液料比对提取率的影响的研究，响应面设计液料比选定在30 ∶1（mL/mg）～50 ∶1（mL/mg）。

图2 液料比对总黄酮提取的影响Fig.2 The effect of liquid and material ratio on the extraction of total flavonoids

3.1.2 提取时间对提取率的影响

提取时间对提取率的影响见图3。

图3 提取时间对总黄酮提取的影响Fig.3 The effect of extraction time on the extraction of total flavonoids

如图3，在确定的因素下（超声功率500 W，提取温度为 60 ℃，液料比为 30 ∶1（mL/mg），提取溶剂为70%乙醇），考察不同提取时间对于提取量的影响。图中曲线呈现先升后降的趋势，在50 min～60 min 下降的可能是因为此时的固相浓度差较小，总黄酮很难进一步溶解；另外也可能是超声时间过长，会存在机械和空化作用以及热效应的影响[20]。通过对不同提取时间对提取率的影响的研究，响应面设计提取时间选在40 min～60 min。

3.1.3 乙醇浓度对提取率的影响

乙醇浓度对提取率的影响见图4。在确定的因素下（超声功率500 W，提取温度为60 ℃，液料比为30 ∶1（mL/mg），提取时间 40 min），考察加入不同浓度乙醇对提取量的影响。由图4 可知乙醇浓度在50%至70%过程中提取量不断增加，而在70%至80%过程中目标提取物提取量呈现下降趋势，下降的原因可能是香椿叶中的非目标成分溶出影响了目标提取物的溶出。通过对不同乙醇浓度对提取率的影响的研究，我们选取60%～80%乙醇浓度进行响应面分析。

图4 乙醇浓度对总黄酮提取的影响Fig.4 The effect of ethanol concentration on the extraction of total flavonoids

3.2 响应面分析法优化提取总黄酮的结果及分析

采用Design-Expert 8.0.5 软件，按照Box-Behnken试验设计，以单因素试验为基础，以液料比、浸提时间、乙醇浓度为自变量，以总黄酮物质含量为响应值，进行响应面试验。试验设计方案及结果见表3。

对表3 的试验结果进行响应面分析，各因素对总黄酮的影响用公式表示即Y=37.01+5.25A+0.17B－1.09C-1.79AB-1.38AC+1.84BC-5.32A2-2.99B2-4.79C2。对香椿叶总黄酮提取率的回归模型进行方差分析，结果见表4。

表3 超声波辅助乙醇提取总黄酮的响应面分析方案及结果Table 3 Response surface analysis scheme and results of ultrasonic assisted ethanol extraction of total flavonoids

表4 总黄酮提取率回归分析结果Table 4 Regression analysis of extraction rate of total flavonoids

由表4 可知，香椿叶总黄酮的回归模型P＜0.000 1达到极显著差异，回归系数R2=0.981 9 说明对于香椿叶总黄酮的回归模型的拟合程度较好，因此可以使用该回归模型来对香椿叶总黄酮提取条件进行分析。从表4 中可以发现 A、A2、B2、C2达到极显著水平，C 达到显著水平，AB 和BC 交互项对提取率也有显著影响。影响香椿叶总黄酮提取率的顺序依次为A、C、B。各因素交互影响的响应面图见图5。

由图5 可以看出，B 与A 以及B 与C 的交互作用对提取率影响显著，这与方差分析的结果一致。

图5 各因素交互影响的响应面图Fig.5 Response surface graph of the interaction of each factor

对公式做进一步分析，得到超声波提取香椿叶总黄酮的最优参数为：液料比41.20 ∶1（mL/mg）、时间35.77 min、乙醇浓度为65.31%，预测香椿叶总黄酮的提取量为38.59 mg/g。考虑到实际操作，将提取的液料比设定为 41 ∶1（mL/mg）、时间设定为 36 min、乙醇浓度设定为65%，在我们结合实际设定的工艺条件下进行了3 次香椿叶总黄酮的提取，测得提取量为（38.96±0.049）mg/g，说明响应面法的优化工艺参数是可靠的。

3.3 抑菌试验结果与分析

用不同浓度总黄酮提取液对3 种供试菌（大肠杆菌、枯草芽孢杆菌以及金黄色葡萄球菌）检测香椿叶总黄酮的抑菌情况，根据不同浓度的香椿叶总黄酮的抑菌情况得到结果见表5。

表5 不同浓度提取液对5 种细菌的抑菌效果Table 5 Bacteriostasis effect of different concentration extracts on three kinds of bacteria

如表5 所示，香椿叶总黄酮原液、50%原液、25%原液对3 种细菌的抑菌效果均是对金黄色葡萄球菌的抑制最明显，对大肠杆菌的抑制相对最差，并且香椿叶总黄酮原液的浓度越大对于3 种细菌的抑菌效果越强。这一结果与徐强采用AB-8 的大孔树脂用70%的乙醇纯化的黄酮产物的抑菌作用效果大致相同，即香椿叶总黄酮的浓度越高对细菌的抑制效果越明显；香椿叶总黄酮对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最明显，但是徐强的结果显示香椿叶黄酮对大肠杆菌的抑菌效果强于枯草芽孢杆菌，这可能是因为徐强采用的是香椿老叶，会对结果产生影响[6]。

4 讨论与结论

近年来有很多提取香椿叶总黄酮的研究，陈丛瑾[21]以总黄酮含量为评价指标，采用正交试验对香椿叶总黄酮半仿生提取工艺进行优化，但是所得工艺条件时间长、成本较高。正交试验由于已经是一种比较成熟的试验，所以能够满足一般的试验需求，但与正交试验相比，响应面法具有预测性好和能够更好的反映各因素交互作用对试验结果的影响[22]。乙醇辅助超声波法辅助提取香椿叶中总黄酮化合物，这种操作方法具有操作简便、能耗低、不会破坏生物活性、无毒副作用的优点，所以本试验采用此方法提取目标提取物，再通过响应面法优化提取条件。

本试验具体研究了液料比、提取时间、乙醇浓度对香椿叶总黄酮的影响，通过响应面法优化得到的最佳提取参数为：液料比 41 ∶1（mL/mg）、时间 36 min、乙醇浓度 65%，测得提取量为（38.96±0.049）mg/g，与理论值38.59 mg/g 接近。本试验还探究了目标提取物对3 种不同供试菌种的抑菌作用，发现对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最明显。这为香椿叶的有效成分提取及综合应用提供了借鉴。