高脂血症大鼠血液中氨基酸代谢标志物分析

江洁怡 肖观林 曾志浩 蔡大可

1 广东省中医药工程技术研究院/广东省中医药研究开发重点实验室(广州 510095)

2 广州中医药大学第五临床医学院(广州 510405)

高脂血症(hyperlipidemia)是指血浆中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和/或低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)过高和/或高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)过低的一种全身脂代谢异常疾病，也称血脂异常[1]。高脂血症作为内分泌系统疾病，其病症的发生与机体内器官的代谢问题有关，如内环境失衡、微生态调节等，但目前临床上对高脂血症的检测仍主要停留在 “血脂”这一实验室指标上，而忽略了其伴随的其它病理生理的改变。事实上，在高脂血症发病过程中，不仅会出现脂代谢的紊乱，还会出现糖代谢、氨基酸代谢、氧化应激及炎症等，其病症的出现是多种代谢通路异常，机体多功能发生紊乱的综合结果[2- 4]。单纯的以“血脂”指标作为诊断和研究高脂血症相关疾病的手段并不全面，容易掩盖人体内分泌系统异常的真正病因，同时，“血脂”指标只能“宣判”结果而无法实现早期诊断。

氨基酸(amino acids)是构建机体蛋白质分子的基本组成单位，也是调节营养物质代谢及维持机体内环境稳态的重要物质基础，具有广泛的生物学功能，氨基酸的含量检测常常作为机体内分泌平衡及相关器官功能情况的侧面反映与辅诊依据[5- 10]，还可用于疾病的早期诊断[11- 13]。本研究通过建立食饵性高脂血症大鼠模型，采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS/MS)法，对高脂血症模型大鼠血液中氨基酸谱进行测定，并通过统计学分析对比造模前后大鼠血液中氨基酸谱的变化，寻找高脂血症代谢特异性氨基酸，为高脂血症临床早发现、早治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物

SD 大鼠20只，SPF 级，体质量180～220 g，雌雄各半，均由广东省医学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号SCXK(粤)2008- 0002。实验环境：广东省中医研究所SPF 级动物实验室，合格证号SYXK(粤)2010- 0059。所有大鼠均遵循实验动物伦理学要求进行饲养及实验操作。

1.2 试药

高脂饲料(批号D12492)，广东省医学实验动物中心；胆固醇试剂盒(批号120241)、甘油三酯试剂盒(批号130441)、高密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒(批号130521)、低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒(批号140561)，中生北控生物科技股份有限公司；非诺贝特胶囊(批号20667)，法国利博福尼制药公司；氨基酸混合对照品(批号BCBT9759，天门冬氨酸(Asp)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)、脯氨酸(Pro)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、谷氨酸(Glu)、苯丙氨酸(Phe)、赖氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)，(批号BCBT8201，浓度100 pmol/μL)，美国Agilent公司；甲醇、甲酸、乙腈(色谱纯)，美国Fisher公司；蒸馏水，广州屈臣氏食品饮料有限公司。

1.3 仪器

ExionLC AC液相色谱仪、X500R QTOF质谱仪，美国Sciex公司；XS205DU型电子分析天平，瑞士Mettler TOLEDO公司；JJ3000型动物电子秤，美国G&G 公司；3K30型低温冷冻离心机，德国 SIGMA 公司；Varioskan Flash 全波长多功能酶标仪，美国Thermo 公司。

1.4 高脂血症模型的建立

取SPF级SD大鼠20只，每组10只，雌雄各半，按体质量随机均分为正常对照组、模型对照组。除正常对照组外，其余大鼠给予高脂饲料，连续4周。

1.5 生化指标的测定

禁食24 h，于末次给药1 h后，眼眶后静脉丛取血，离心(3000 r/min，10 min)分离血清，部分血清于- 80 ℃冰箱中保存，备用。取血清，采用多功能酶标仪测定各组大鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C含量。

1.6 UPLC-Q-TOF-MS/MS法测定

1.6.1 供试品溶液的制备 将血清于室温下解冻溶解，取20 μL血清样品于EP管中，加280 μL乙腈，涡旋30 s，静置10 min，离心(13 000 r/min，10 min)，取上清液，即得。

1.6.2 色谱与质谱条件 色谱柱：Waters XBridge Amide(150 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流动相：0.2%甲酸甲醇溶液(A)- 0.2%甲酸水溶液(B)，梯度洗脱：0～3 min，85% A；3～6.5 min，85%～50% A；6.5～9 min，50% A，9～9.1 min，50%～85% A，9.1～15 min，85% A；体积流量0.4 mL/min；柱温 40 ℃；进样量 1 μL。Sciex X500R QTOF 质谱仪，电喷雾离子源(ESI)；采用多反应监测模式(MRM)进行正离子检测；雾化气378.9 kPa，辅助气 378.9 kPa，气帘气 241.1 kPa，雾化温度 550 ℃，喷雾电压(ionspray pressure)为5 500 V，优化后的质谱参数见表1。

表1 优化的质谱条件参数

续表

1.7 统计学方法

采用SPSS 22.0软件对研究中得到数据进行统计学分析。两组结果比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 生化指标与正常对照组比较

模型组TC(t′=7.437 8，P<0.001)、TG(t′=14.466 3，P<0.01)、LDL-C(t′=5.498 5，P<0.01)均升高，而HDL-C(t′=11.773 2，P<0.01)降低，说明造模成功。见表2。

表2 高脂血症模型大鼠的生化指标

2.2 UPLC-Q-TOF-MS/MS法测定

2.2.1 线性关系、检测限和定量限 精密吸取氨基酸混合对照品适量，加甲配制成不同浓度的系列混合对照品溶液，按“1.6.2”项下条件进行测定，以峰面积为纵坐标Y，对相应的对照品浓度为横坐标X，进行线性回归，得回归方程、相关系数和线性范围；分别以信噪比(S/N)约为3和10计算检测限(LOD)及定量限(LOQ)，见表3、图1。

表3 线性关系、检测限和定量限考察结果

2.2.2 精密度试验 精密吸取同一混合对照品溶液1 μL，照拟定的条件连续测定6次，记录各峰峰面积，结果测得各氨基酸成分峰面积RSD(n=6)均<3%，表明该色谱条件下，仪器精密度良好。

2.2.3 稳定性试验 精密吸取制备好的同一供试品溶液1 μL，照拟定的条件，分别在制备样品后第0、4、8、12、16、20、24 h进样，记录各峰峰面积，结果各氨基酸成分峰面积RSD(n=6)均<3%，表明样品溶液24小时内稳定。

图1 氨基酸成分的MRM提取离子流色谱

表4 高脂血症模型大鼠血清中氨基酸的变化

2.2.4 重复性试验 取同一份血清样品，按“1.6.1”项下方法制备供试品，平行6份，并照拟定的条件测定，记录各氨基酸成分峰面积并计算其含量，结果各氨基酸成分的平均含量在4.526～28.312 μmol/L，RSD(n=6)均<6%，表明该方法具有良好的重复性。

2.2.5 回收率试验 取已知含量的同一份血清样品6份，分别精密加入等量的氨基酸混合对照品，按“1.6.1”项下方法制备供试品溶液，照拟定的条件测定，记录各峰峰面积并计算含量结果，计算回收率。结果各氨基酸成分的平均回收率分别在96.13%～103.93%，RSD(n=6)均<6%。

2.2.6 样品测定 取各血清样品，按“1.6.1”项下方法制备供试品溶液，照拟定的条件测定，记录各峰峰面积并计算含量结果。结果除Asp、Leu、Ile、Tyr、Arg、His、Glu、Lys在供试品中含量太低，未检测到，其余8种氨基酸成分均被检测到。经独立样本t检验：与正常对照组比较，模型组Met、Phe、Thr、Val五种氨基酸均有降低(t=5.658，2.918，3.486，6.319，P<0.001，0.009，0.003，<0.001)，Pro(t′=4.453，P=0.001)和Gly(t′=2.551，P=0.024<0.01)均有降低，而Ser和Ala均无差异(t=0.789，0.277，P=0.441，0.785>0.05)。结果见表4。

3 讨 论

笔者曾对C18反相色谱柱进行考察，发现氨基酸大多为大极性化合物，在C18柱上保留较弱，而氨基柱对氨基酸的保留较好，故选择氨基柱；在流动相的考察中，发现甲醇-水作为流动相时，部分氨基酸的信号较弱，加入甲酸后，增加了氨基酸的电离，信号增强；考察了35 ℃、40 ℃、45 ℃三种不同柱温对分离效果的影响，结果柱温40 ℃以上时，信号较稳定，故最终选柱温为40 ℃；考察了0.35 mL/min、0.40 mL/min、0.45 mL/min 三种流速对分离效果的影响，结果流速对分离效果影响不大，综合分析时间及仪器耐用性，选0.40 mL/min作为分析流速。最终所建立的含量测定方法专属性高，分离度好。

样品测试时，部分氨基酸信号较低，无法达到检出限，可能与取样浓度较低有关，后续可加强样品的浓度，提高低浓度样品的检出，使检测更加准确。

高脂血症是一种内分泌系统疾病，其病症的出现是多种代谢通路异常、机体多功能发生紊乱的综合结果，其中氨基酸代谢异常，是内分泌失衡及相关器官功能紊乱的重要辅证。本实验检测了高脂血症模型大鼠血液中的14种氨基酸的含量，可以从整体水平上反映高脂血症建模前后氨基酸代谢变化，通过统计分析，进一步印证了高脂血症大鼠存在氨基酸代谢的紊乱，其中Met、Phe、Pro、Thr、Val、Gly等6种氨基酸为其潜在的生物标志物，其中蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、苏氨酸(Thr)、缬氨酸(Val)是人类、其他哺乳动物和禽类正常生长发育所必需的氨基酸(有9种必需氨基酸)，而蛋氨酸是体内主要的甲基供体，苯丙氨酸是多种神经递质的前体，苏氨酸是一种免疫刺激剂，可促进细胞免疫防御功能，缬氨酸能促进身体正常生长，修复组织，调节血糖，并提供需要的能量；脯氨酸(Pro)是由谷氨酸合成的非必需氨基酸，是胶原蛋白的重要组成部分，也是潜在的内源性兴奋毒素/神经毒素；甘氨酸(Gly)属于非极性氨基酸，参与人体的DNA，磷脂和胶原蛋白的生产以及能量的释放。该结果为高脂血症临床早发现、早治疗提供了实验依据；本研究所建立的氨基酸测定方法稳定、可靠，为氨基酸及其结构类似物在复杂体系中的检测的提供了参考。