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光遗传激活DA系统调节运动疲劳大鼠纹状体低频振荡的电生理学研究

2020-01-03陈孟娇赵旭东陈福俊刘晓莉乔德才侯莉娟

体育科学 2019年10期
关键词:多巴胺频段神经元

李 科,陈孟娇,赵旭东,陈福俊,刘晓莉,乔德才,侯莉娟*

(1. 北京师范大学体育与运动学院,北京100875;2. 上海交通大学Bio-X研究院,上海200240; 3. 上海交通大学体育系运动健康工程中心,上海200240)

运动疲劳是竞技运动中普遍存在的现象,也是制约运动水平提高的关键因素。基底神经节接受来自大脑皮层的神经冲动,分别构成直接通路、间接通路和超直接通路对运动控制功能起调节作用。直接通路对运动皮层最终信号输出起兴奋作用,间接通路对运动信息输出起抑制作用(乔德才 等,2014)52。黑质-纹状体DA(Nigra-striatal dopamine,NSDA)系统通过影响直接和间接通路的活动调节基底神经节信息输出,平衡机体运动功能(Rice et al.,2011)。实验室前期研究发现运动疲劳后背外侧纹状体突触间隙增宽,多巴胺2 型受体(Dopamine 2 receptor,D2DR)激动剂可缓解大鼠活动能力的降低,皮层M1 和纹状体同步振荡增强,D2DR 表达下调(侯莉娟 等,2018)45,提示运动疲劳引起的纹状体电活动变化可能与NSDA 系统有关。

“ 中枢疲劳修正假说”认为五羟色胺(5-hydroxy tryptamine,5-HT)/多巴胺(Dopamine,DA)比值升高与中枢疲劳发生有关(Cordeiro et al.,2017)。DA 能神经元以两种放电模式释放 DA,“ 强直型(Tonic)”和“ 时相型(Phasic)”。时相型多巴胺释放由多巴胺神经元的动作电位驱动,导致突触前膜多巴胺浓度快速增加。而强直型多巴胺释放受其他神经元和神经递质再摄取调控,与突触前动作电位无关。与时相型释放相比,强直型释放产生更少的胞外多巴胺。DA 强直型放电促进运动活力,时相型多巴胺放电有助于特定动作的发起(Grace,2016)。Mc-Morris 等(2018)研究认为,DA 放电从时相模式向强直模式的转变可能会降低机体维持目标导向活动的动机进而引起疲劳,实验室前期研究发现运动疲劳后SNc 区DA 能神经元放电频率下降,不规则性增强(乔德才等,2014)53,由此推测,DA 放电模式变化可能是NSDA 系统参与运动疲劳中枢调控的机制之一,然而,并未得到准确的实验证明。光遗传技术利用光敏感蛋白的生物特性并结合病毒转染技术,可以特异性操控目标神经元,模拟神经元的不同放电模式,被视为神经科学领域定向刺激变革性的一项新技术(Rost et al.,2017)。因此本研究采用病毒转染加光遗传技术,采用不同频率的时相型刺激模式特异性激活黑质DA 能神经元,观察其对运动疲劳大鼠纹状体低频振荡的影响,探讨NSDA 系统在运动疲劳中枢调控中的作用。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象与分组

健康雄性 Sprague-Dawley 大鼠(220~240 g),北京维通利华公司提供[SCXK(京)2016—0004]。大鼠分笼饲养、自由饮食、自然光照,适应性饲养1 周后随机分为生理盐水安静组(saline control group,SCG)、光敏蛋白安静组(optogenetics control group,OCG)、运动疲劳组(fatigue group,FG)、假手术运动疲劳组(saline fatigue group,SFG)和光敏蛋白运动疲劳组(optopgenetics fatigue group,OFG),各组 7 只,共 35 只。

1.2 病毒转染及光纤电极埋植

大鼠腹腔注射10% 水合氯醛(0.35 ml/100 g),麻醉后将头部固定于立体定位仪。本实验中OCG、OFG 组在SNc区(AP:-5.3 mm,R:2.0 mm,H:-8.0 mm)注射1 μl rAAVTH-NLS-Cre-WPRE-pA和rAAV-Ef1a-DIO-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE-pA (1:1)混 合 AAV,SCG、SFG 组 注 射1 μl 生理盐水后,在纹状体(AP:0.2~1.2 mm,R:3.0~4.0 mm)的位置钻一个1 mm×1 mm 窗口,在解剖显微镜下植入梯度阵列电极(Stablohm 675,直径35 μm,间距200 μm),10 mm 长的光纤陶瓷头埋植于病毒注射位点处。颅骨暴露脑组织处采用WPI 生物硅胶封口,牙科水泥固定,术后腹腔注射青霉素防治感染。动物手术清醒后,单笼饲养,自由饮水进食,动物房采取12 h 光照,12 h黑暗交替,温度与湿度恒定,详细记录和观察动物的活动状态。实验结束后进行电极定位及光敏蛋白表达鉴定,剔除电极位置未落入背外侧纹状体的大鼠,进入电生理数据统计分析的信号通道数量为SCG(N=24 通道/3 只)、OCG(N=56 通道/7 只)、FG(N=40 通道/5 只)、SFG(N=24 通道/3 只)和OFG(N=56 通道/7 只)共200 个。

1.3 运动疲劳模型建立

术后恢复3 周及1 周的适应性跑台训练后,采用改良的Bedford 递增负荷运动方案(Hu et al.,2015)建立运动疲劳模型,运动负荷分为3 级:一级运动速度为8.2 m/min,运动时间15 min;二级运动速度为15 m/min,运动时间15 min;三级运动速度为20 m/min,运动直至力竭,连续进行7 天;同时将安静组大鼠置于跑台一侧。大鼠力竭标准为不能维持预定跑速,滞留于跑道挡板不动,使用光、电、声刺激驱赶仍无效,并伴有呼吸急促、俯卧跑台、垂头不起等行为表现。

1.4 纹状体LFPs信号采集

信号通过Cerebus-128 多通道信号采集系统采集,采样频率为2 kHz;通过lowpass 250 Hz 滤波获得LFPs,并通过Neuromotive 系统同步追踪大鼠行为活动,30 min/次。将 SCG、OCG、SFG、OFG 大鼠置于记录盒中,分别给予3 Hz 刺激频率,1 个脉冲,每个脉冲时间8 ms,总时长10 s(Howe et al.,2016)和 20 Hz 刺激频率,10 个脉冲,每个脉冲时间 10 ms,总时长 10 s(Da Silva et al.,2018)的蓝光(473 nm)刺激,刺激完成后给予50 s 恢复时间;FG 不给光刺激。记录光激活黑质DA 能神经元对SCG/OCG 及1 天、7天力竭即刻SFG/OFG 大鼠纹状体LFPs 的影响。

1.5 数据处理

利用NeuroExplorer 5 x86 & Matlab 2015a 平台对原始LFPs 电生理数据进行分析;采用SPSS 20.0 统计软件进行统计学分析,Sigmaplot 12.5 软件作图,实验结果以均数±标准差(M±SD)表示。采用方差分析(One-Way ANOVA)运动疲劳对电生理指标及不同频率刺激效果的影响,组间均值差异选择LSD/Tamhane’s T2 检验,采用配对样本t检验分析光遗传刺激对PSD 值的影响,以P<0.05 表示差异具有显著性。

2 研究结果

2.1 SNc中光敏蛋白表达结果

注射携带 TH 启动子和 DIO-hChR2(H134R)-mCherry的腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV),经过 3 周以上时间表达后,转染结果如图1 所示,mCherry 红色荧光在SNc 区出现,根据病毒表达原理可知,AAV 只能在Cre 重组酶存在时正常表达,而在TH 启动子作用下仅有DA 能神经元能表达Cre 重组酶,故红色荧光只可能来自于使AAV正常表达的DA 能神经元。该结果证明,AAV 病毒的立体定位注射位置准确,大鼠已成功表达ChR2。

2.1 运动疲劳对大鼠纹状体LFPs的影响

节律性振荡是大脑研究中最广泛的现象之一,哺乳动物低频(<100 Hz)振荡通过协调不同脑区之间的信息传递参与神经调控,如认知、运动等行为,低频振荡作为基底神经节中的一种生理现象同时也与运动调控有关(Fountas et al.,2017)1。通过比较 1 天力竭与 7 天重复力竭后大鼠纹状体LFPs 数据变化分析运动疲劳程度累积对大鼠纹状体低频振荡的影响,结果如图2 所示。与1 天力竭相比,7 天重复力竭大鼠纹状体低频段(<40 Hz)振荡功率谱密度(power spectral density,PSD)值有所升高(图2A),但经过24 h 恢复期后有所下降;与1 天力竭相比,7 天重复力竭大鼠α 频段(7~13 Hz)PSD 值显著升高(P<0.05,图2B),与1 天力竭相比,7 天重复力竭大鼠β 频段(15~30 Hz)PSD 值显著升高(P<0.05,图2C)。

图1 SNc区DA能神经元ChR2基于cre重组酶的特异性表达Figure 1. ChR2 Selectively Expressed in DA Neuron with Cre Recombinase

图2 运动疲劳对大鼠纹状体LFPs的影响Figure 2. Effects of Exercise-induced Fatigue on LFPs in Striatum

2.2 不同频率光刺激对运动疲劳大鼠纹状体LFPs的影响。

不同光刺激对OCG 和SCG 大鼠纹状体LFPs 的影响如图 3、4 所示,与 SCG 相比,3 Hz、20 Hz 光刺激会降低 OCG大鼠 α 频段 PSD 值(P<0.05,图 3C、D)。 与 SCG 相比,3 Hz、20 Hz 光刺激会降低 OCG 大鼠 β 频段 PSD 值(P<0.05,图 4C、D)。不同光刺激对 OFG 和 SFG 大鼠纹状体LFPs 的影响如图 5、6、7 所示,3 Hz、20 Hz 光刺激会降低 1天力竭 OFG 大鼠 STR 的 α 和 β 频段 PSD 值(P<0.05,图5);20 Hz 光刺激会降低 7 天重复力竭 OFG 大鼠 STR 的 α和β 频段PSD 值(P<0.05),而3 Hz 光刺激降低效应不明显(P>0.05,图6)。与3 Hz 刺激相比,20 Hz 光刺激改善7天重复力竭大鼠纹状体异常低频振荡的效应更明显(P<0.05,图7)。

图3 不同频率光刺激对正常状态纹状体α频段振荡的影响Figure 3. Effect of Different Optogenetics Stimulation on the Power Spectral Density of α Band in Normal Rats

图4 不同频率光刺激对正常状态纹状体β振荡的影响Figure 4. Effect of Different Optogenetics Stimulation on the Power Spectral Density of β Band in Normal Rats

图5 不同频率光刺激对1天力竭大鼠纹状体LFPs的影响Figure 5. Effect of Different Optogenetics Stimulation on the Power Spectral Density of 1D Exhausted Rats

图6 不同频率光刺激对7天重复力竭大鼠纹状体LFPs的影响Figure 6. Effect of Different Optogenetics Stimulation on the Pow‐er Spectral Density of 7D Exhausted Rats

图7 不同频率光刺激对大鼠纹状体LFPs标准化比值的影响(On/Pre)Figure 7. Effect of Different Optogenetics Stimulation on the Nor‐malized Ratio of Power Spectral Density of Rats with Exercise-in‐duced Fatigue

3 讨论与分析

3.1 DA放电模式改变参与运动疲劳中枢调控

皮层-基底神经节环路中的β 振荡活动(13~30 Hz)与强直收缩和姿势控制相关(Brittain et al.,2014)。高幅β 振荡是皮层广泛抑制的表现,抑制GABA 神经递质的再摄取会增加β 振幅和运动相关β 振荡减弱。β 振荡调节指标——运动后β 振荡回弹(Post-movement beta rebound,PMBR)与 GABA 能神经元抑制相关(Gaetz et al.,2011)。Fry 等(2017)研究证实,以次最大收缩强度达到疲劳时,PMBR 增加。α 频段振荡通常认为具有抑制效应,Haegens 等(2011)研究发现,在 M1 区中 α 频段活动与神经元放电频率变化相反,α 频段活动在运动执行前呈去同步化,在运动执行时呈同步化状态(Brinkman et al.,2014,2016)。但也有研究认为,皮层感觉运动区域的α频段活动下降是信息处理的标志,进行单侧运动时,对侧感觉运动皮层 α 频段振幅减小(Fry et al.,2017)371,亨廷顿症病理机制研究显示是患者α 振荡幅度降低,基底神经节低频α 频段(8~10 Hz)振荡活动增加也是帕金森病(Parkinson’s disease,PD)的病理表现之一(Bender et al.,2018;Nimmrich et al.,2015),PD 模型大鼠皮层 M1、M2 区及苍白球外侧部GPe 中α 频段(5~13 Hz)活动明显增高(Ge et al.,2012)。α 和β 频段节律都有一种事件相关去同步化效应,在运动执行时活动减弱(Brittain et al.,2014)3。实验室前期研究大鼠在运动过程中皮层脑电α频段所占比例显著增加(侯莉娟等,2018)51,本部分研究证实运动疲劳后纹状体α 频段、β 频段活动增强,且增高幅度与疲劳累积程度相关。

图8 DA系统参与运动疲劳大鼠低频振荡调控的可能机制示意图Figure 8. DA Neurons in SNc Regulates Oscillation on Exercise-induced Fatigue Rats

在正常状态下,强直型和时相型多巴胺释放相结合以维持高水平的多巴胺,并且β 振荡也处于生理范围;在PD 中,DA 能神经元的缺失意味着释放到纹状体和STN 突触前的多巴胺较少,净多巴胺总量(强直型和时相型多巴胺释放模式的总和)处于低水平,因此β 振荡升高并超过生理水平;用左旋多巴或多巴胺激动剂治疗PD 患者促进时相型多巴胺释放改变了净多巴胺的水平,此时β 振荡接 近 于 正 常 水 平(Brittain et al.,2014;Jenkinson et al.,2011)。而DA 替代疗法可通过降低异常的β 振荡而减少PD 患者的运动迟缓和身体僵硬等运动障碍(Wang et al.,2017)。因此,β 振荡水平变化可能与DA 时相型释放相关。而 DA 也可减少 α 振荡(Kim et al.,2014),与视觉刺激相关的DA 增多可以使PD 患者丘脑底核STN 中α 频段去同步化(Huebl et al.,2014)。DA 神经元时相型放电可有 效 激 活 D2DR(Marcott et al.,2014),DA 与 高 活 性 的D2DR 结合,还可通过抑制间接通路从而降低异常β 振荡(Rice et al.,2008)。D2DR 激动剂阿扑吗啡能抑制PD 患者和 PD 动物模型过高的 β 振荡(Berke,2009)。前期研究发现,D2DR 激动剂干预可降低运动疲劳大鼠纹状体α、β 频段PSD 值,DA 时相型放电模式还有助于动作发起和执行(Da Silva et al.,;2018Howe et al.,2016)。本部分实验研究发现,1D 力竭时,两种时相型释放都可降低运动疲劳大鼠纹状体α、β 频段PSD 值;而7D 重复力竭时,给以低频时相型刺激、低幅度DA 释放对大鼠纹状体α、β 频段PSD 值的影响差异不具有显著性,而高频时相型刺激、高幅度DA 释放可显著降低7D 重复力竭大鼠的纹状体α、β 频段PSD 值,这证实DA 放电模式通过含量影响运动疲劳纹状体α、β 频段PSD 值参与运动疲劳中枢调控。

3.2 光激活DA 系统影响纹状体低频振荡可能的生理学机制

LFPs 是指记录电极尖端附近局部区域兴奋性和抑制性突触后电位的总和,振荡主要发生在LFPs 信号中,是由局部神经元同步的阈下电活动引起。β 频段振荡活动降低与运动控制核团的去抑制活动有关,计算模型显示α频段振荡主要影响间接通路,通过快速去抑制实现对黑质网状部SNr 的抑制进而促进间接通路信息传输发挥运动抑制作用(Fountas et al.,2017)16。皮层-纹状体突触可塑性中由内源性大麻素(endocannabinoid,eCB)介导的长时 程 抑 制(long-term depression,LTD)也 依 赖 于 DA 及D2DR(Xu et al.,2018),D2DR 被 DA 激活后,抑制 cAMP/PKA 活性,导致G-蛋白信号转导调节子-4 磷酸化水平降低,使代谢型谷氨酸受体1/5 耦联的Gq 蛋白去抑制,从而促进eCB 生成,与突触前膜上的CB1 受体结合后诱发eCB-LTD(Cerovic et al.,2013)。纹状体 D2DR 敲除或使用D2DR 拮抗剂均不能成功诱导出LTD(Kreitzer et al.,2007)。实验室前期研究结果发现运动疲劳后皮层-纹状体 eCB-LTD 受损、D2DR 表达下调(侯莉娟 等,2018;Ma et al.,2018)45。由此推测,运动疲劳后基底神经节间接通路过度兴奋。

离体实验证实,MSN 膜电位的离子电导受DA 调节,DA 可使MSN 静息电位保持在钾离子平衡电位附近,NSDA 系统受损大鼠纹状体神经元钾离子电流活性降低,膜电位以去极化为主,放电频率增加,兴奋性增强;而D2DR可通过抑制L 型钙通道电流从而降低纹状体神经元兴奋性(Tseng et al.,2001)。间接通路中型多棘神经元(Indirect pathway medium spiny neuron,iMSN)兴奋性主要受D2DR 和腺苷酸 A2A 受体(Adenosine 2A receptors,A2AR)共同调节,A2AR 拮抗剂SCH-58261 可显著改善DA 缺失小鼠iMSN 的兴奋性、抑制突触后电流、减轻谷氨酸的兴奋性毒性作用,DA 缺失后A2AR 上调RGS4 表达,引起M4自身受体功能减弱和胆碱能信号传导增强,而A2AR 拮抗剂可慢阻止这种升高(Peterson et al.,2012),激活纹状体胆碱能神经元受体也会使β 振荡幅度增高(Pittman-polletta et al.,2018)。SCH58261 和 D2DR 激动剂喹吡罗经纹状体微注射后,可以抑制运动疲劳时iMSN 的过度兴奋,降低 β、γ 频段振幅,延缓疲劳发生(Hou et al.,2017)。A2AR 也参与 iMSN 中长时程增强(Long-term potentiation,LTP)诱导,A2AR 发挥与 D1DR 相似的作用,通过激活PKA,引起DARPP-32 磷酸化参与LTP 形成。 DARPP-32通过不同残基的磷酸化将DA、腺苷和Glu 等递质或调质对纹状体的调控整合在一起。A2AR 和D2DR 还可通过调节Thr34-DARPP-32 磷酸化程度而使其下游靶点磷酸化增加、蛋白合成增多、受体活化等发挥对运动疲劳的调控作用(Nishi et al.,2005)。由此推测,7D 力竭后高频时相刺激引起DA 释放通过D2DR/A2AR 影响抑制纹状体兴奋性发挥改善运动疲劳大鼠行为活动的作用。

4 研究结论

运动疲劳后大鼠纹状体α、β 频段振荡显著升高光遗传激活黑质DA 系统可改善1 天力竭大鼠纹状体α、β频段 PSD 值;与 3 Hz 相比,20 Hz 刺激可显著改善 7 天重复力竭大鼠纹状体α、β 频段PSD 值,提示DA 放电模式改变引起运动疲劳纹状体低频振荡变化是导致大鼠运动疲劳症状产生的原因之一,运动疲劳使大鼠纹状体α、β 频段兴奋性增高与DA 放电模式有关,DA 时相型放电通过影响iMSN 中A2AR 及D2DR 活性改善大鼠异常低频振荡参与运动疲劳中枢调控。

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