SEPTIN9 基因与结直肠癌诊断及预后的研究进展

杨 宁,李鸿雁,吴常青,李 非

(1.首都医科大学宣武医院,普通外科,北京 100053;2.北京大学第一医院密云医院,心胸血管外科,北京 101500)

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是全球第三大常见癌症,第四大致死癌症(仅次于肺癌、肝癌和胃癌)。 2015 年我国结直肠癌的新发病例数为37.63 万人,因结直肠癌死亡患者19.10 万人[1]。早期CRC 的5 年生存率为90%,进展期的CRC 则低至14%[2],及早发现疾病是降低死亡率的关键。

目前对CRC 的筛查基于粪便的试验有粪便潜血试验(FOBT)、粪便免疫化学试验(FIT)及多靶点粪便-脱氧核糖核酸(FIT-DNA),但对粪便的厌恶造成该类试验筛查率低。 结肠镜检查具有侵袭性,偶尔伴有严重的并发症[3]。 癌胚抗原(CEA)和糖类抗原199 (CA199)表现不佳,而不作为CRC 早期检测的标志物[4]。

循环游离的脱氧核糖核酸(DNA)作为癌症血液标志物近年来备受关注。 而其中的SEPTIN9 基因因其在结直肠癌病变早期高度甲基化使得其成为结直肠癌早期诊断、治疗及判断预后的潜在标志物,目前已成为该领域研究热点。 本文将对外周血SEPTIN9 及与结直肠癌相关研究及其进展进行综述。

1 SEPTIN9 基因和mSEPT9

1.1 SEPTIN9 基因

SEPTIN 基因家族共有14 个成员(SEPT1 ～SEPT14)组成,由Scott 等[5]于1971 年在酿酒酵母中筛选温度敏感性突变基因过程中发现。 SEPTIN9基因属于其家族中的一员,广泛于除植物以外的所有真核细胞中,位于染色体17q25.3,长约24×104bp,含有17 个外显子,有18 种不同的转录产物和编码15 个多肽。 其5’端产生6 个不同的mRNA 变异剪接体(即SEPTIN9-v1、v2、v3、v4、v4∗和v5),而3’端的可产生3 种不同信使mRNA (即SV1、SV2和SV3)[6]。

1.2 SEPTIN9 甲基化与CRC 发生发展

SEPTIN9 基因编码SEPTIN9 蛋白,该蛋白在细胞代谢中发挥着重要的生理作用。 研究发现SEPTIN9 蛋白能够调节细胞生长,防止细胞分裂过快或以不受控制的方式进行分裂增殖,具有相应的抑癌作用[7]。

DNA 甲基化即甲基加到胞嘧啶或腺嘌呤核苷酸,主要发生在-胞嘧啶-磷酸酯-腺嘌呤-(-CpG-)位点,是正常发育过程中的表观遗传现象,对胚胎发育和体细胞分裂都是至关重要的,且通常以很高的保真度传递给子细胞。 已有研究表明[8],哺乳动物中有60%～90%的CpG 是甲基化的,未甲基化的CpG 通常以团簇形式存在,称为CpG 岛。 CpG 岛通常存在于许多基因的50 个调控区域,尤其是启动子区域。 当甲基化发生在CpG 岛时,启动子区域高水平的5-甲基胞嘧啶基因在转录上是沉默的,阻碍SEPTIN9 蛋白表达,从而促进CRC 发生发展。

1.3 入血方式及其节律

Mandel 和Metais 于1948 年首次于外周血中发现游离基因片段(cfDNA),mSEPT9 作为cfDNA 的一种,近年来被广泛研究。 其入血方式有多种理论,其中“肿瘤细胞的主动释放和坏死”占主流地位。 研究表明,mSEPT9 是从肿瘤细胞中被积极释放到血液循环中的,它可以通过类似转染的机制促进易感细胞向癌细胞转化,这种现象目前被称为“基因转移”理论[9]。 同时,相比于凋亡所产生的180 bp 或更短的cfDNA,在癌症患者外周血中发现的大于250 bp 的mSEPT9 更符合坏死所释放的cfDNA[10],这表明坏死可能是外周血mSEPT9 的主要来源。 坏死的主要原因可能是肿瘤的生长过快超出了血液供应。

哺乳动物的昼夜节律是由下丘脑视交叉上核控制的,它调节代谢稳态、免疫反应、细胞增殖及凋亡、DNA 损伤反应和肿瘤抑制等多种机制[11]。Toóth 等[12]研究表明外周血mSEPT9 水平在CRC患者的样本中存在微弱的昼夜节律性。 mSEPT9 浓度最高时为午夜平均(31.99±31.33)ng/mL,最低时为下午6 时平均(27.05±16.97)ng/mL。 该研究同时发现在mSEPT9 浓度较低的情况下,日间活动可影响mSEPT9 检测结果,因此可以通过在早晨早些时候收集样本来提高筛选灵敏度。 然而Toóth 研究的样本数量过少,这种节律性的存在与否需要更多的实验研究来证实。

2 mSEPT9 试验

DNA 甲基化的检测方法很多,根据样本预处理不同大体可以分为三种类型,分别为消化酶法、亲和富集法及重亚硫酸盐转化法。 目前CRC 患者外周血mSEPT9 检测的方法(mSEPT9 试验)主要是重亚硫酸盐转化法。 mSEPT9 试验即应用某种试剂盒检测外周血SEPTIN9 基因V2 区胞嘧啶甲基化程度。 该试验是在2008 年开发的,最初用于不符合结肠镜检查患者早期CRC 检测,后经不断改进,于2016 年美国FDA 批准用于50～75 岁的平均风险人群的筛查。

2.1 试剂盒

表观基因组学公司于2008 年首次研究了外周血mSEPT9 检测癌症的性能并随之推出第一代Epi proColon 试剂盒(Epi proColon 1.0)。 Church 等[13]大型前瞻性研究报道,Epi proColon 1.0 检出CRC患者敏感性I 期为35%,II 期63%,III 期46%,IV 期77.4%,总体特异性为91.4%。 Nian 等[14]对25 项研究的meta 分析中指出Epi proColon 1.0 试验的总体敏感性为71%,总体特异性为92%。 可以看出,第一代Epi proColon 在CRC 筛查方面已经表现出很高的敏感性。

目前,第二代检测试剂盒Epi proColon 2.0 已经上市。 与第一代Epi proColon 试验相比,第二代检测方法在提高效率的同时,达到了更高的敏感性和特异性。 Wang 等[15]指出应用Epi proColon 2.0 后,检测灵敏度从48.2%～73.3%提高到约71.00%～95.6%,特异性从80.0%～91.5%提高到84.8%～98.9%。 根据Potter 等[16]的报告,Epi proColon 2.0可以检测低至7.8 pg/mL 的甲基化SEPTIN9。

此外,新兴的senicolon 检测法同样具有较好性能。 Wu 等[17]的RESEP 机会性筛查研究中表明,senicolon 检测法的结直肠癌的检出率为76.6%,特异性为95.9%。 且该种检测方法具有更优化的技术、更便捷的操作和更低的成本,与商业化的mSEPT9 检测方法Epi proColon 2.0 相比,其性能没有差异。 然而该方法需要更多的临床试验数据加以证实。

2.2 算法及选择

由于mSEPT9 试验是在未甲基化cfDNA 的大背景下检测微量的mSEPT9 而设计的,所以大多数研究都进行了多次聚合酶链式反应(PCR)以增强检测敏感性。 mSET9 试验的算法规定在这m 次PCR 重复实验中至少需要出现n 次阳性,才可以判定为此次试验阳性,该规定计作n/m 算法(n≤m)。常用的有1/1、1/2、1/3 和2/3 四种算法,1/1 算法为1 次PCR 重复实验中要求出现1 个阳性,则判断样品为阳性;1/2 算法为2 次PCR 重复实验中要求至少出现1 次阳性,则判断样品为阳性;1/3 算法为3 次PCR 重复试验中要求至少出现1 次阳性,则判断样品为阳性;2/3 算法为3 次PCR 重复试验中要求至少出现2 次阳性,则判断样品为阳性。

在使用多种算法的研究中可以观察到不同的算法拥有不同的检测性能。 Song 等[18]对19 项相关研究不同算法的灵敏度和特异性进行了分析比较,结果显示,1/3 算法的敏感性(0.80)显著高于其他所有算法,特异性(0.85)显著低于其他所有算法,而2/3 算法的特异性最高(0.95)。 2/3 和1/1 算法的敏感性和特异性非常相似(敏感性：0.74 vs 0.73,特异性：0.95 vs 0.93)。 1/2 算法灵敏度最低(0.59),特异性(0.91)可接受。 可以看出,2/3 算法的整体性能最好,而1/3 算法的感敏度最好。 1/3算法以较低的特异性为代价提供了最佳的敏感性,而2/3 算法在敏感性和特异性之间提供了最佳的平衡,这与Nian 等[14]研究结论一致。

算法的选择应该基于研究的特定需求。 如果优先级是排除健康的阴性患者,应该使用特异性较高的算法,此时推荐使用1/3 算法,但是,如果优先级是识别尽可能多的真正病人来提高疾病检出率,如筛选试验,应该使用敏感度最高的算法,此时推荐2/3 算法。

2014—2018 年国内外关于mSEPT9 检测结直肠癌不同试剂盒不同算法的敏感性和特异性检验结果,详见表1。

表1 mSEPT9 检测结直肠癌的敏感性和特异性结果Table 1 Sensitivity and specificity of mSEPT9 in colorectal cancer detection

2.3 试验敏感性与临床病理参数的关系

mSEPT9 试验敏感性主要取决于外周血SEPTIN9 水平,而外周血SEPTIN9 主要来源于肿瘤细胞的释放,不同分期的肿瘤,其肿瘤大小,浸润程度,分化程度均大有不同,因此其外周血SEPTIN9水平也有显著差异。 He 等[19]对其进行了多中心的系统性研究,结果表明早期CRC(0 期和1 期)的敏感性明显低于晚期CRC(II、III 和IV 期)。 Jin 等[20]和Ørntoft 等[21]的研究结果也证实了此点。 Song等[22]研究发现血浆mSEPT9 水平与肿瘤最大直径呈线性关系。 Fu 等[23]研究表明肿瘤大小为＞5 cm的CRC 患者mSEPT9 阳性率明显高于肿瘤大小≤5 cm 的CRC 患者(77.3% vs 51.7%)。 He 等[19]研究中对不同浸润程度的CRC 进行比较,结果显示未触及浆膜层的CRC 的mSEPT9 敏感性低于触及或生长于浆膜层外的肿瘤。 分化程度越低mSEPT9 检出率越高,Fu 等[23]研究同样指出与组织学分级较低(1 级和2 级)的CRC 病例相比,组织学分级较高的3 级和4 级mSEPT9 阳性率较高,具有统计学意义(75.0% vs 51.5%)。

He 等[19]还进一步研究比较了CRC 常见肿瘤位置的敏感性,得出mSEPT9 在升结肠、横结肠、降结肠、乙状结肠、直肠的敏感性无差异,这与Song等[24]、Church 等[13]及Jin 等[20]研究结果一致。

3 mSEPT9 试验在CRC 患者中的临床应用

3.1 结直肠癌筛查及早期诊断

mSEPT9 试验在人群筛查试验中有很高的敏感性和特异性。 PRESEPT 研究[13]是迄今为止唯一对平均风险无症状人群进行的筛查研究。 该研究显示mSEPT9 试验检测CRC 的总体敏感性为48.2%,总体特异性为91.5%。 Wu 等[17]的RESEPT 研究中,首次报道了针对中国人mSEPT9 试验机会性筛查(有症状高危人群)结果。 该研究指出mSEPT9试验的敏感性为76.6%,特异性为95.9%。 此外,在最近Song 等[25]一项机会性筛选研究中,mSEPT9试验的敏感性为75.1%,特异性为95.1%。 可以看出,mSEPT9 试验在CRC 人群筛查中表现出良好性能。

除人群筛查试验外,多项临床病例研究也表明,mSEPT9 是CRC 筛查的可靠生物标记物。 Wang等[15]2018 年对多项临床病例研究进行meta 分析后指出,应用Epi proColon 2.0 检测mSEPT9 的敏感度约为71.0%～95.6%,特异性约为84.8%～98.9%。Nian 等[14]2017 年的meta 分析(25 项研究)中指出应用Epi proColon 1.0 试验的总体敏感性为71%,总体特异性为92%,Epi proColon 2.0 试验的总体敏感性为76%,总体特异性为94%。 Sun 等[26]2018 年的meta 分析(29 项研究)报告的敏感性范围在37%至96%之间,特异性约79%到99%,同时该meta 分析还利用受试者工作特征曲线下方面积(AUC)和诊断优势比(DOR)研究了总体测试性能以及病例间的紧密性和诊断效率,证实了甲基化SEPTIN9 无论在1/3 和2/3 算法中都是CRC 良好的肿瘤标志物。

虽然mSEPT9 试验对CRC 的检测具有足够的敏感性和特异性,早期筛查诊断CRC 的能力更值得我们关注及检验。 对此,Song 等[24]一项meta 分析(19 项研究)将各阶段的阳性检出率(PDR)汇总分析,得出随着临床分期的增加,其检出率呈上升趋势,更重要的是,在目前的体外诊断方法中mSEPT9试验早期CRC 检出率相当高(I 期和II 期的检出率分别为59.6%和85.7%)。 使用2/3 或1/1 算法进行mSEPT9 试验检测,分别检测出大约50%的I 期CRC 和70%的II 期CRC,都代表早期CRC 的高PDR。 因此mSEPT9 试验对早期CRC 筛查及诊断具有高度敏感性及特异性。

3.2 CRC 手术疗效评价、预后预测及监测复发

常规外科手术疗效多以创伤程度、恢复速度及术后生存时间等方面加以评价,然而利用cfDNA 水平评价手术疗效研究很少。 Song 等[22]首次研究了mSEPT9 试验在CRC 手术疗效评价的作用,结果显示97.5%(117/120)的受试者术后1 d mSEPT9 水平明显下降,且超过一半的患者外周血mSEPT9 下降到检测不到的水平,术后7 d mSEPT9 水平进一步下降。 Fu 等[23]对19 例经手术治疗的结直肠癌患者术前和术后的mSEPT9 进行配对研究,结果显示,16 例中有14 例(87.5%)mSEPT9 由术前阳性转为术后阴性。 可见,血浆mSEPT9 水平与CRC 具有显著负相关性。 手术疗效越好,术后mSEPT9 水平越低,甚至转为阴性。

另外有研究表明,mSEPT9 对CRC 的复发及转移具有较好的提示作用。 Song 等[22]通过监测mSEPT9 水平对120 名患者的预后预测及监测复发能力进行了评价,结果显示：mSEPT9 检测阳性的患者死亡风险高于检测阴性的患者(危险比[HR] =2.51;95%置信区间：1.03 ～6.12;p=0.036),表明mSEPT9 是手术治疗后预后及复发、转移的监测指标,这与Fu 等[23]研究结果一致。 此外在Tham等[27]一项对150 名CRC 患者为期5 年的前瞻性队列研究结果显示,血清中SEPTIN9 的高甲基化水平是肿瘤复发和肿瘤特异性生存不良的独立预测因子。 术后mSEPT9 状态可能直接提示患者是否存在隐匿性肿瘤细胞,并预测术后疾病复发可能。

3.3 作为辅助分子参数,参与TNM 分期

结肠镜检查和最新影像学对CRC 的准确分期是治疗计划和预后的基础。 定期更新的UICC 和TNM 分级系统仍然是全球分级标准,仅仅根据放射学上确定的解剖程度来分期癌变病变,忽视了对实体肿瘤生物学行为和侵袭性的新认识,而且在准确性方面也有相当大的缺陷。 SEPTIN9 甲基化作为辅助分子分期参数表现突出,能够以增量的方式区分病理性UICC 和TNM 分期,因此与已建立的TNM 系统相结合,能够提高现有方案的效率[28]。

3.4 与其他标记物(或方法)对比及联合应用

CEA 作为广谱肿瘤标志物,对于胃肠道(尤其是结直肠癌)及其他脏器的肿瘤监测具有一定提示作用, 但对肿瘤的早期诊断效果不佳。 但将mSEPT9 同CEA 联合应用时则显示出优于二者单独使用的效果。 Wu 等[17]研究结果表明,单独使用mSEPT9 法的灵敏度为77.0%,CEA 则为41.3%,而mSEPT9+CEA 联合法敏感性可达到86.4%。 所以与单独使用mSEPT9 相比,更推荐mSEPT9+CEA 联合方法作为CRC 患者的筛查。

大便潜血试验作为消化系统疾病的常规检查,其阳性结果表明存在急性或慢性消化道出血,常提示溃疡,肿瘤等疾病的存在。 但其对疾病的特异性极低。 虽不作为特异性筛查指标,但作为常规筛查选项,其阳性结果则同样可增加mSEPT9 试验的敏感性。 Xie 等[29]研究表明mSEPT9+FOBT 联合法提高了CRC 筛查的敏感性,与单独使用SEPTIN9 有显著性差异(84.1% vs 61.8%)。 Johnson 等[30]及Wu等[17]同样证实联合应用的有效性。

粪便免疫化学试验(FIT)是近年来新兴的结肠癌筛查方法。 其通过免疫组化方法检测粪便中的血红蛋白,其结果较粪便潜血试验具有更高的精确性。 关于FIT 与mSEPT9 试验在结肠癌早期诊断中的敏感性比较,目前仍有较大争议[20,26],但两者联合应用的敏感性明确高于二者的单独应用[19-21]。

mSEPT9 作为新兴的CRC 早期诊断标志物具有较高的特异性及敏感性,而联合其他显著性较高的标记物筛查CRC 则可获得更好的效果。 但由于每个标记物的假阳性病例的积累,特异性可能会降低,因此,这些组合的特异性还需要进一步检查。最佳组合可能是最能平衡敏感性和特异性的组合。

4 存在问题

mSEPT9 试验虽然对CRC 疾病所有阶段显示出高敏感性和特异性,但目前检查仍未实现全自动化,检测过程仍需较多人工操作,成本较高。 由Ladabaum 等[31]进行的成本模拟分析显示,与FOBT、FIT 和结肠镜检查等现有筛查策略相比,基于mSEPT9 的筛查方法并没有节省成本。 但在群体水平上mSEPT9 能够增加人群的参筛比例,在可接受的成本下可以让CRC 患者获得更多其它受益。

CRC 通常由腺瘤演变而来,非侵袭性肿瘤(腺瘤性息肉)的检测是CRC 筛查计划的重要组成部分。 早期发现这些癌前病变,能够明显降低CRC 的死亡率。 Nian 等[14]在2017 年发表的meta 分析结果显示,mSEPT9 对腺瘤和息肉的检测灵敏度分别为15%和5%,2018 年Fu 等[23]研究报道中指出腺瘤患者mSEPT9 阳性率明显低于CRC (7.9% vs 61.2%),因此mSEPT9 对CRC 癌前病变的筛查仍有较大缺陷。

5 小结及未来展望

综上所述,外周血甲基化SEPTIN9 与结直肠癌的发病机制密切相关,外周血中SEPTIN9 基因甲基化水平不仅可以用于结直肠癌的筛查及早期诊断,还可以用于CRC 手术疗效评价及预后监测。 但其具体效果评价仍需要更多的临床评估。

在未来,破译DNA 甲基化在内的表观遗传信息,并将其应用于选择合适的检测方法和开发相应的治疗方法,从而进一步优化mSEPT9 检测后,有可能改变结直肠癌的诊断和治疗,提高预后。 同时如将mSEPT9 与已建立的TNM 系统相结合,将有助于CRC 的分子疾病分期,可能会提高现有方案的效率达到个性化治疗。 近年来虽然酪氨酸激酶抑制剂(TKI)靶向治疗和程序性死亡-1/程序性死亡配体-1(PD-1/PD-L1)免疫治疗已经在肿瘤治疗方面有了重大突破,但尚无任何治疗与基因甲基化状态相关。 基因甲基化相关治疗的建立可能是癌症治疗的又一个巨大飞跃。