miR-146a和miR-155与慢性阻塞性肺疾病炎症表型的相关性分析

席卓娜 乔亚红 程方圆

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一种较为常见的呼吸系统疾病，以持续性气流受限为主要特征[1]。目前临床症状和肺功能是COPD诊断与病情分级的主要依据，但易受年龄等因素影响，不能全面评估病情[2]。对COPD表型的研究是临床研究热点之一，明确COPD表型有利于在治疗期间选取合适治疗手段并提高患者预后情况。目前COPD表型分类方法主要包括临床表型、生理表型、炎症表型、影像学表型等[3]。COPD与有毒颗粒或气体的慢性炎性反应增强有关，因此炎症表型具有判断COPD病情程度的天然优势。同时有研究表明，miR-146a、miR-155均与炎症反应相关[4-5]，因此本研究探讨miR-146a和miR-155与炎症表型相关性，进一步完善对COPD炎症表型分类的认识。

资料与方法

一、一般资料

收集2015年7月～2019年6月本院收治的COPD患者179例，其中男85例，女94例，年龄30～61岁。纳入标准：符合COPD诊断中急性加重诊断标准[6]；研究前未接受糖皮质、β2受体激动剂治疗。排除标准：严重心肺并发症患者；合并肺部肿瘤、支气管哮喘等慢性疾病患者。根据诱导痰分析炎症细胞比例的不同，COPD分为嗜酸性粒细胞型(嗜酸性粒细胞占总细胞的2.5%以上)、嗜中性粒细胞型(嗜中性粒细胞数为61%以上)、混合粒细胞性(嗜酸性粒细胞2.5%以上，嗜中性粒细胞数为61%以上)及粒细胞缺乏型(嗜酸性粒细胞2.5%以下，嗜中性粒细胞数为61%以下)[7]。四组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)(见表1)。

表1 四组一般资料比较

二、方法

1 标本采集

所有研究对象均于就诊次日清晨抽取肘静脉血5 mL，3000 r/min、-20℃离心20min，取上清，平均分为两份，做好标记-80℃保存。

2 qRT-PCR法检测血清miR-146a、miR-155水平

参照Trizol说明书提取血清总RNA，应用Bio Rad逆转录试剂盒逆转录为cDNA，25℃ 5min，42℃30 min，85℃ 5min灭活逆转录酶活性，用去离子水将cDNA稀释10倍后-20℃保存。进行qRT-PCR操作。程序设定为：95 ℃预热3min，(95 ℃ 30 s ，60 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s)循环35，72℃ 5min终止反应。miR-146a、miR-155以U6为内参基因，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物设计(见表2)。采用2-ΔΔCt算法计算miR-146a、miR-155相对表达量。

表2 qRT-PCR引物序列

3 各表型特征指标检测

取1.2.1血清标本，采用一氧化氮测定仪检测FeNO水平；采用比色法测定血清MPO水平，采用722S分光光度计(上海精密科学仪器有限公司生产)，在460 nm处读取吸光度(OD)值,试剂为南京建成生物工程研究所的MPO测试盒；采用免疫荧光定量法检测C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)水平，试剂盒为南京基蛋生物科技有限公司的CRP试剂盒。

三、统计学分析

结 果

一、指标检测

与粒细胞缺乏型相比，嗜酸性粒细胞型患者FeNO水平显著升高(P<0.05)，MPO、CRP水平差异不显著(P>0.05)，嗜中性粒细胞型患者MPO、CRP水平显著升高(P<0.05)，FeNO水平差异不显著(P>0.05)，混合粒细胞型患者FeNO、MPO、CRP水平均显著升高(P<0..05)；与嗜中性粒细胞型相比，嗜酸性粒细胞型、混合粒细胞型患者FeNO水平显著升高(P<0.05)；与嗜酸性粒细胞相比，嗜中性粒细胞型、混合粒细胞型患者MPO、CRP水平显著升高(P<0.05)(见表3)。

表3 各组FeNO、MPO、CRP水平检测

注：a、b、c分别代表与粒细胞缺乏型、嗜酸性粒细胞型、嗜中性粒细胞型相比，P<0.05。

二、各炎症表型血清miR-146a、miR-155表达水平

与粒细胞缺乏型相比，嗜酸性粒细胞型miR-146a水平显著升高(P<0..05)，嗜中性粒细胞型MPO、CRP、miR-155水平显著升高(P<0.05)，混合粒细胞型miR-146a、miR-155水平均显著升高(P<0.05)；与嗜中性粒细胞型相比，嗜酸性粒细胞型、混合粒细胞型miR-146a水平显著升高(P<0.05)；与嗜酸性粒细胞相比，嗜中性粒细胞型、混合粒细胞型miR-155水平显著升高(P<0.05)(见表4)。

表4 各表型血清miR-146a、miR-155表达水平比较

注：a、b、c分别代表与粒细胞缺乏型、嗜酸性粒细胞型、嗜中性粒细胞型相比，P<0.05。

三、血清miR-146a、miR-155表达水平与炎症分型相关性分析

Pearson相关性分析表明，嗜酸性粒细胞型患者中，miR-146a水平与FeNO、CRP呈正相关(r=0.659，P<0.05)；嗜中性粒细胞型患者中，miR-155水平与MPO、CRP水平呈正相关(r=0.628，0.605，P=0.007)，混合粒细胞型患者中miR-146a、miR-155水平与FeNO、MPO、CRP水平均呈正相关(r=0.724，0.514，0.671，0.605，0.525，0.509，P<0.05)，粒细胞缺乏型患者中，miR-146a、miR-155水平与FeNO、MPO、CRP水平均无相关性(r=0.121，0.106，0.210，0.229，0.107，0.213，P>0.05)(见表5)。

表5 血清miR-146a、miR-155表达水平与炎症分型相关性分析

讨 论

COPD是一种具有气流阻塞特征的慢性支气管炎和肺气肿，是一种常见的慢性疾病。与气道、肺脏对有毒颗粒或气体的慢性炎性反应增强有关，致残率与病死率极高，严重危害患者生存状态。目前临床诊断COPD主要通过常规肺功能检查，但其方法具有一定局限性，同一肺功能水平患者可能有不同临床表现、生存状态，对同一种治疗方法敏感性亦不同。研究不同表型可区分不同COPD患者，有助于为患者提供临床个性化治疗方案，更具有针对性。目前对COPD表型分类方法多种多样，包括临床表型、影像学表型、炎症表型等。其中炎症表型能够精细明确COPD的致病来源，可作判断COPD急性加重并评估预后的参考。炎症反应与炎性标志物具有密切相关性，炎性标志物能对炎症反应作出更精确表达。有研究表明，miR-146a、miR-155与炎症反应均有相关性，但其在COPD炎症分型中研究甚少，为此本研究通过分析COPD患者血清miR-146a、miR-155水平与COPD炎症分型及其特异性炎性标志物相关性，为COPD的靶向治疗提供理论基础。

以嗜酸性粒细胞为主的COPD患病者血清炎症介质水平较低，对标准治疗反应良好，Pazdrak等[8]研究表明，COPD患者有35%患者嗜酸性粒细胞升高，此类患者对糖皮质激素较为敏感，取得疗效优于其他类型。Bjermer[9]研究表明，FeNO与呼吸系统疾病的严重程度密切相关。Wagener等[10]研究表明FeNO可反映气道嗜酸性粒细胞的炎症程度，并可准确量化，不受时间控制，随时检测，迅速得结果。本研究中嗜酸性粒细胞型患者FeNO水平显著高于其他类型患者，表明FeNO水平可作为COPD患者嗜酸性粒细胞型分型的指标。miR-146a由miR-146加工产生，位于5q34。研究表明，miR-146a在炎症环境下高表达[11]。Yang等[12]研究表明，miR-146a水平可能与嗜酸性粒细胞密切相关。本研究中，嗜酸性粒细胞型患者血清miR-146a水平显著高于粒细胞缺乏型及嗜中性粒细胞患者，且相关性分析显示，嗜酸性粒细胞型患者血清miR-146a水平与FeNO水平正相关，提示miR-146a水平与嗜酸性粒细胞型COPD患者密切相关，嗜酸性粒细胞型COPD患者可能是由于miR-146a水平升高导致。

中性粒细胞型患者细菌感染多，需将强药物治疗，因此住院时间及康复时间显著延长[13]。MPO是由中性粒细胞、单核细胞和某些巨噬细胞分泌的血红素蛋白酶，可与中性粒细胞表面抗体结合，通过p38MAKP途径激活中性粒细胞样爆发、脱颗粒等反应，促进中性粒细胞参与炎症反应，介导炎症组织损伤[14]。CRP水平是区分细菌感染与病毒感染的敏感指标[15]。本研究中，中性粒细胞型患者MPO、CRP水平显著高于粒细胞缺乏型、嗜酸性粒细胞型患者，提示MPO、CRP水平可作为判断中性粒细胞的分型标准，二者高表达显示COPD患者属于中性细胞型。miR-155是一个典型的多功能microRNA,位于非编码区基因Bic内，在免疫、炎症的调控中发挥重要作用[16-17]。有研究表明肺炎患者中性粒细胞活检中miR-155水平显著升高[18]。本研究中，嗜中性粒细胞型患者miR-155水平显著高于粒细胞缺乏型、嗜酸性粒细胞型患者，此外，嗜中性粒细胞型患者血清miR-155水平与血清MPO、CRP水平正相关，提示嗜中性粒细胞型COPD患者可能是由于miR-155水平升高导致。粒细胞缺乏型患者血清炎症介质较低，对标准治疗反应良好，与miR-146a、miR-155水平均无相关性，而混合粒细胞型患者血清miR-146a、miR-155水平均升高，且二者均与FeNO、MPO、CRP水平正相关，从另一个侧面反映miR-146a、miR-155水平与COPD的分型有关，可能为临床个性化、精确化治疗提供参考。

综上所述，血清miR-146a、miR-155水平与COPD患者炎症分型密切相关，为临床个性化治疗提供理论依据，但本研究病理术较少，纳入可能不全面，需进一步扩大样本进行研究。