磁性分子印迹纳米粒子对四环素的富集分离

高婉茹，李跑，黄昭，覃思，曹亚男，刘霞

（湖南农业大学食品科学技术学院食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南长沙410128）

四环素类抗生素（tetracyclines，TCs）具有广谱抗菌活性，因其价格低廉、抗菌力强，常作为饲料添加剂及预防、治疗感染性疾病使用[1-2]。但是，若不遵守药物的休药期、超量使用四环素类药物等，必然导致其在水体、土壤及动物源性食品中的残留，进而对环境和人体健康造成极大危害[3-5]，因此，监控动物源性食品中的TCs 残留是食品安全的重点之一，且检测方法是其重要的技术支撑。

食品因其组成基质复杂，且TCs 残留量低，分析检测前一般需要对食品中的TCs 进行富集分离，以消除基质干扰，提高分析检测的准确度和灵敏度。传统的待测物富集分离方法有液液萃取、固相萃取、基质辅助固相分散萃取等[6]，这些方法虽有其优点，但也各有缺点，如操作相对繁琐、处理时间长，污染环境，分离难等问题[7-9]。因此，如何快速、准确的将样品中残留的TCs 富集分离，是其高精准检测的关键所在。

近年来，Fe3O4纳米粒子（Fe3O4nanoparticles，Fe3O4NPs）由于毒性低、价廉易得、比表面积大、形态大小可控、稳定性好，且通过外加磁场便能简单快速的分离待测物，已广泛被应用作为富集分离的载体[10-12]。分子印迹技术是从仿生的角度，用人工的方法制备出对某一特定分子具有选择性和亲和性的高分子化合物技术，通过该技术制备的高分子材料被称为分子印迹聚合物（molecularly imprinted polymers，MIPs）[13-14]。当模板分子被去除后，由于其具有与模板分子形状、大小及官能团完全匹配的印迹孔穴，能够选择性的识别模板分子及其结构类似物[15-17]。MIPs 具有制备简单、成本低、物理和化学稳定性好和可重复利用等优点[18]，在低浓度或复杂基质中也能高选择性地富集目标物。将具有独特磁性能的Fe3O4NPs 与特异性识别的MIPs 相结合，便可在外加磁场作用下实现定向移动，直接选择性的富集分离目标物[19]。与传统的分子印迹材料相比，省去了离心、过滤等过程，达到了简便快速分离的目的，使得样品前处理更加快速高效[20-22]。本研究以化学共沉淀法制备了表面羧基功能化的Fe3O4NPs，并以此作为磁性载体，以四环素为模板分子，制备出四环素磁性分子印迹纳米粒子（magnetic molecularly imprinted polymers nanoparticles，MMIPs NPs）。利用该MMIPs NPs 对四环素进行富集分离，获得吸附性能最优的MMIPs NPs 的制备条件和吸附条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

六水合三氯化铁（FeCl3·6H2O）、四水合氯化亚铁（FeCl2·4H2O）、氢氧化钠、柠檬酸、聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）、无水乙醇、甲醇和乙酸（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；四环素（tetracycline，TC）（分析纯）：上海源叶生物科技有限公司；甲基丙烯酸（α-methylacrylic acid，MAA）、偶氮二异丁腈（2，2-azobisisobutyronitrile，AIBN）（分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司；乙二醇二甲基丙烯酸酯（ethylene glycol dimethacrylate，EGDMA）（分析纯）：上海阿拉丁试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

紫外-可见分光光度计（UV-2450）：日本岛津公司；多功能酶标仪（Multiskan GO）：美国Thermo Scientific 公司；超声波清洗仪（KQ-100）：昆山市超声仪器有限公司；旋涡振荡仪（VORTEX-2）：美国Scientific Industries 公司；真空干燥箱（DZF-6030A）：上海一恒科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 羧基化Fe3O4NPs 的制备

采用化学共沉淀法一步制备表面羧基化的Fe3O4NPs，即18.5 mmol FeCl3·6H2O 溶解于100 mL 去离子水中，之后转移至250 mL 四口烧瓶中，通氮除氧并进行机械搅拌，然后加入10 mmol FeCl2·4H2O，升温至80 ℃。一次性加入40 mL 的NaOH 溶液（2 mol/L），溶液由棕黄色变黑后，加入1.2 g 柠檬酸，在550 r/min 下搅拌反应1 h。待反应结束后，将产物借助外加磁场进行分离，用去离子水反复洗涤至中性，并于50 ℃条件下真空干燥，作为后续制备MMIPs NPs 的载体。

1.3.2 MMIPs NPs 制备条件的优化

1.3.2.1 TC 检测波长的确定

分别对制备过程中所用到的模板分子TC、功能单体MAA、交联剂EGDMA 以及引发剂AIBN，用紫外-可见分光光度计扫描紫外全波段光谱，确定TC 的最佳检测波长。

1.3.2.2 MMIPs NPs 的制备方法

将模板分子TC 及功能单体MAA 加入到10 mL去离子水和乙醇的混合溶液（9 ∶1，体积比）中搅拌30 min，以制备预组装溶液。取制备好的羧基化Fe3O4NPs，20 mmol 的交联剂EGDMA，加至由TC 与MAA组成的预组装溶液中，超声处理30 min，以制备预聚合溶液。将制得的预聚合溶液加入到含有0.4 g PVP 的100 mL 乙醇溶液中，通氮除氧，并在300 r/min 条件下搅拌，同时升温至60 ℃，然后加入0.1 g 引发剂AIBN，反应时间为24 h。反应结束后，利用外加磁场对聚合物进行分离，用甲醇-乙酸混合溶液洗涤数次，直至在最佳检测波长处检测不到洗脱液中的TC，再用甲醇和去离子水将聚合物洗涤至中性，并于50 ℃条件下真空干燥。

1.3.2.3 模板分子TC 洗脱液的确定

根据1.3.2.2 的制备方法，分别采用体积比为9 ∶1和8 ∶2 甲醇-乙酸混合溶液，超声洗涤MMIPs NPs 数次以去除模板分子TC。依据最佳检测波长处的吸光度值考察其洗脱效果，确定洗脱液的最优比例。

1.3.2.4 MMIPs NPs 对TC 的吸附试验

准确称取4 mg MMIPs NPs 至5 mL 离心管中，向其中加入2 mL 0.08 mg/mL 的TC 溶液，25 ℃恒温振荡12 h，经磁铁分离后，取上清液过0.22 μm 滤膜，在最佳检测波长处测定其吸光度值，每个样本平行3 次。根据MMIPs NPs 对TC 的吸附容量Q、吸附效率及分配系数K，确定制备MMIPs NPs 的最佳条件，其计算公式如下所示[23-24]：

式中：C0为TC 的初始浓度，mg/mL；Cs为上清液中TC 的浓度，mg/mL；V 为溶液的体积，mL；m 为MMIPs NPs 的质量，g；Cp为TC 与MMIPs NPs 的结合量。

1.3.2.5 TC 与MAA 比例的确定

根据1.3.2.2 的制备方法，固定羧基化Fe3O4NPs的添加量，TC、EGDMA 的比例，在相同的合成条件下，改变TC 与MAA 的添加比例（摩尔比1 ∶2、1 ∶4、1 ∶8、1 ∶10），确定TC 与MAA 的最优比例。

1.3.2.6 羧基化Fe3O4NPs 添加量的确定

根据1.3.2.2 的制备方法，固定TC、MAA、EGDMA的比例，在相同合成条件下，改变羧基化Fe3O4NPs 的添加量（0.25、0.5、0.75、1.0 g），确定羧基化Fe3O4NPs的最适合添加量。

1.3.3 MMIPs NPs 富集分离TC

1.3.3.1 MMIPs NPs 添加量对吸附效率的影响

分别准确称取最优条件下制备的MMIPs NPs 2、4、6、8、10、12、15 mg 至5 mL 离心管中，每管各加入2 mL 0.08 mg/mL 的TC 溶液，25 ℃恒温振荡12 h，经磁铁分离后，取上清液过0.22 μm 滤膜，在最佳检测波长处测定吸光度值，每个样本平行3 次。根据TC 浓度的前后变化，计算其吸附效率，考察MMIPs NPs 添加量对TC吸附效率的影响。

1.3.3.2 反应时间对吸附效率的影响

准确称取1.3.2.2 制备的MMIPs NPs 10 mg 至5 mL离心管中，每管各加入2 mL 0.08 mg/mL 的TC 溶液，25 ℃分别振荡10、20、30、40、50、60 min，经磁铁分离后，取上清液过0.22 μm 滤膜，在最佳检测波长处测定吸光度值，每个样本平行3 次。通过标准曲线求出吸附后上清液的浓度，根据TC 浓度的前后变化，计算其吸附效率，考察反应时间对TC 吸附效率的影响。

2 结果与分析

2.1 TC 检测波长的确定

MAA、EGDMA、AIBN 以及TC 的紫外光谱见图1。

图1 MAA、EGDMA、AIBN 以及TC 的紫外光谱Fig.1 UV spectra of MAA，EGDMA，AIBN and TC

由图1 可明显看出，TC 的最大紫外吸收波长为355 nm；MAA、EGDMA、AIBN 的最大紫外吸收波长分别在306、308、346 nm 处，故后续试验均以355 nm 作为检测TC 的最佳波长。

2.2 模板分子洗脱液的确定

洗脱液的选择对试验结果有着直接影响。在甲醇中添加一定量的乙酸可以增加溶液的洗脱作用力，破坏模板分子和聚合物之间的结合力，有效减少模板分子的渗漏，达到更好的洗脱效果。不同比例洗脱液对MMIPs NPs 的洗脱效果见图2。

图2 不同比例洗脱液对MMIPs NPs 洗脱效果的紫外光谱Fig.2 UV spectra of MMIPs NPs eluted with eluents of different ratios

如图2 所示，经甲醇-乙酸溶液（8 ∶2，体积比）洗脱后溶液中TC 含量大于甲醇-乙酸溶液（9 ∶1，体积比）洗脱后的，即前者的洗脱效果优于后者；随着洗脱次数的增加，不同体积比甲醇-乙酸溶液对TC 的洗脱效果差距逐渐减小。由于甲醇的极性较大，考虑到洗脱时可能会破坏分子印迹形成的孔穴，故选择甲醇-乙酸溶液（8 ∶2，体积比）作为模板分子的洗脱液。

2.3 TC 与MAA 比例的确定

模板分子与功能单体之间的相互作用力的大小直接影响到聚合物的吸附性能，相互作用力越大，特异性越好[25]。因此，合适的模板分子与功能单体比例对MMIPs NPs 的制备尤为重要。不同比例TC 与MAA 制备MMIPs NPs 的吸附性能见表1。

表1 不同比例TC 与MAA 制备MMIPs NPs 的吸附性能Table 1 Adsorption properties of MMIPs NPs prepared by different ratio of TC to MAA

结果如表1 所示，MMIPs NPs 对TC 的吸附容量、吸附效率及分配系数均随着TC 与MAA 摩尔比的增加先是增加然后减少，当TC 与MAA 摩尔比为1 ∶8时，其吸附容量、吸附效率及分配系数达到最大，分别为35.30 mg/g、88.25%及3 754.35 mL/g，故选择TC 与MAA 的摩尔比为1 ∶8 进行后续试验。

2.4 羧基化Fe3O4 NPs 添加量的确定

磁性载体的添加量直接影响了MMIPs NPs 的稳定性和富集分离待测物的能力。因此，合适的磁性载体添加量对MMIPs NPs 的制备尤为重要。不同羧基化Fe3O4NPs 添加量制备MMIPs NPs 的吸附性能见表2。

表2 不同羧基化Fe3O4 NPs 添加量制备MMIPs NPs 的吸附性能Table 2 Adsorption properties of MMIPs NPs prepared by different additions of carboxyl-modified Fe3O4 NPs

如表2 所示，随着羧基化Fe3O4NPs 添加量的增加，MMIPs NPs 对TC 的吸附容量、吸附效率及分配系数也随之增加，当羧基化Fe3O4NPs 添加量为0.5 g 时，其吸附容量、吸附效率及分配系数均达到最大值，分别为35.30 mg/g、88.25%及3 754.35 mL/g，之后再增加羧基化Fe3O4NPs 的添加量，吸附效率开始减小，故选择羧基化Fe3O4NPs 的最优添加量为0.5 g。

2.5 MMIPs NPs 添加量对吸附效率的影响

不同MMIPs NPs 添加量对TC 吸附效率的影响见图3。

图3 不同MMIPs NPs 添加量对TC 吸附效率的影响Fig.3 Effect of MMIPs NPs on the adsorption efficiency of TC

如图3 所示，不同添加量的MMIPs NPs 对TC 的3次平行吸附效率的平均值分别为82.79%、88.85%、91.40%、94.89%、95.01%及95.08%，随着MMIPs NPs添加量的增加，对TC 的吸附效率也随之增加。当MMIPs NPs 的添加量为10 mg 时，吸附效率达到94.89%，而MMIPs NPs 的添加量为15 mg 时的吸附效率仅比添加量为10 mg 时提高了0.19%，吸附效率不再显著增加。从经济环保的角度考虑，选择MMIPs NPs 添加量为10 mg 进行下一步试验。

2.6 反应时间对吸附效率的影响

反应时间对TC 吸附效率的影响见图4。

图4 不同反应时间对TC 吸附效率的影响Fig.4 Effect of reaction time on the adsorption efficiency of TC

如图4 所示，不同反应时间3 次平行吸附效率的平均值分别为80.47 %、85.56 %、87.81 %、94.10 %、94.68%及95.03%，随着MMIPs NPs 与TC 结合时间的增加，吸附效率随之增加。当MMIPs NPs 吸附TC 反应时间在40、50、60 min 时，吸附效率不再显著增加，反应时间在60 min 时，吸附效率达到最高95.03%，时间较短时MMIPs NPs 与TC 的结合不够充分。当反应时间在40 min 时吸附效率已经达到94.10%，比30 min时的吸附效率提高了6.29%，且与60 min 时的吸附效率差别不大。

3 结论

MMIPs NPs 以其在样品前处理过程中能快速富集分离待测物、特异性强等优势，已成为现代研究的热点。本文以羧基化的Fe3O4NPs 为磁性载体，TC 为模板分子，MAA 为功能单体，EGDMA 为交联剂，利用表面分子印迹技术，对TC 具有特异性识别的MMIPs NPs的制备条件进行了优化，进一步对MMIPs NPs 富集分离TC 的最优吸附效率进行研究。结果表明，所制备的MMIPs NPs 对TC 具有良好的吸附能力，当TC 溶液浓度为0.08 mg/mL，体积为2 mL，MMIPs NPs 的添加量为10 mg，反应时间为40 min 时，吸附效率可达94.10%。经上述条件优化后，大大提升了MMIPs NPs 富集分离TC 的能力，且该法制备过程简单，可快速磁性分离，使得食品中TCs 的富集分离更加简便高效。