从Wnt 通路抑制因子表观遗传修饰调控 研究重楼皂苷Ⅶ抗结直肠癌机制

陈鸣旺 高舒影 刘海光 唐清珠 罗宏标

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是最常见的癌症之一，也是导致癌症相关死亡的主要原因之一。年新发病例37.63 万人，年死亡率19.10 万人。据统计CRC 在美国的患病率和致死率均排名第三位，尽管在手术技术和新辅助化疗方面取得了相当大的进步，但CRC 的生存率仍未明显提高［1-3］。结直肠癌是一个多步骤过程，涉及遗传和表观遗传改变的逐步积累，癌症发展的分子机制仍不清楚，因此目前治疗选择有限，塞来昔布等非甾体抗炎药对大肠腺瘤有一定的预防作用，而5-氟尿嘧啶等抗代谢物对CRC 患者有治疗作用，但非甾体抗炎药会发生心血管疾病的风险，抗代谢物的持续使用对人体会有一定的毒性，包括骨髓毒性和胃肠道毒性，限制其长期使用［4-5］。因此，需要寻找具有更强特异性和更低毒性的新型治疗性药物。天然产物已被证明是抗癌药物的优良和可靠来源［6］，重楼皂苷VII（polyphyllin，PPLVII）是从植物重楼中提取的甾体皂苷类，具有免疫调节、抗炎和抗肿瘤等生物活性［7］，已成功应用于预防结直肠瘤变的IIA 期临床试验。重楼是一种百合科植物，重楼根茎中含有多种生物活性成分，如甾体皂苷，从植物中提取的多种皂苷可以抑制肿瘤的生长和转移［8］， 例如人参皂苷能有效抑制小鼠结肠癌细胞的转 移［9］。因此，PPLVII 对癌细胞的作用机制值得研究。研究发现miR-590-3p 在结肠癌组织和细胞系中表达上调，miR-590-3p 在体外实验中可以显著促进结肠癌细胞的生长和增殖，研究发现［10］Wnt 抑制因子1（WIF1）和Dickkopf 相关蛋白1（DKK1）是miR-590-3p 的直接靶标。Wnt 通路抑制因子1可以诱导G1 期细胞周期阻滞，可以caspase-3 依赖性的方式触发细胞凋亡，抑制结直肠癌细胞株SW-620 的生长。在本研究中，我们从重楼中提取了一种甾体皂苷即PPLVII，通过小鼠结肠直肠癌模型从Wnt 通路抑制因子1（WIF1）表观遗传修饰调控研究其对结直肠癌细胞影响的机制。

资料与方法

一、实验动物

从Slaccas 实验动物公司（中国上海）获得 30 只5 周龄ICR 雌性小鼠。本实验根据动物保护和使用委员会的标准在无病原体条件下饲养，所有的实验动物程序都符合动物护理和使用委员会的审查和批准。

二、建立结直肠癌小鼠模型和分组

选择30 只小鼠，将小鼠平均分为3 组：对照组、模型组和PPLVII 治疗组。对照组小鼠不作处理。模型组、PPLVII 组小鼠采用腹腔注射1，2-二甲基肼（15 mg/kg），一周后在无菌非酸化饮用水中给予小鼠2%的右旋糖酐硫酸钠进行小鼠结直肠癌模型的建立。从第9 周至实验结束（第20 周），模型组、PPLVII 组小鼠分别腹腔注射生理盐水和PPLVII。每天对小鼠进行外观、食物摄取、体重、粪便浓度、直肠出血的评估，所有小鼠均于第 20 周因过量服用乙醚而死亡。大肠用PBS 冲洗并切除，测量其长度（从回盲交界处到肛门边缘），取肿瘤组织置于10%中性缓冲福尔马林固定至少24 小时进行组织病理学检查。结肠黏膜用玻璃片小心地刮掉，快速置于液氮中储存，直到处理完毕。

三、观测指标及方法

1.采用硅胶柱色谱、SephadexLH-20 凝胶柱色谱和高效液相色谱等分离方法，从重楼根茎醇提物的正丁醇萃取部位分离得到PPLVII。

2. TUNEL 免疫组织化学分析：采用TUNEL法检测小鼠的肿瘤细胞凋亡情况，冷冻切片用4%多聚甲醛固定，用末端脱氧核苷转移酶缓冲液孵育，染色切片在尼康显微镜下观察。

3. 免疫蛋白印迹分析检测β-连环蛋白的表达：分别取肿瘤组织和结肠黏膜组织在裂解缓冲液（pH=7.9）中重新悬浮或匀浆10 mM Hepes， 10 mM KCl，0.1 mM EDTA，1 mm DTT，加上蛋白酶抑制剂亮肽素10 mg/mL，抑肽酶10 mg/mL， 0.1 mmol/L PMSF。15% SDS 聚丙烯酰胺凝胶上电泳，转移至硝化纤维素膜，用含有TBS 的缓冲液阻断，0.05%吐温-20 和5%脱脂牛奶室温下封闭2 小时。然后在48 ℃的温度下用不同的一抗孵育过夜，然后用hrp 偶联的二抗孵育过夜。在含有0.05%吐温-20 的TBS 缓冲液中三次洗涤10 分钟后，使用TMA-6 试剂盒检测，实验独立重复三次。

4. 应用双抗体夹心法ELISA（sandwich ELISA） 检测cleaved caspase-3、cleaved caspase-8、cleaved caspase-9、Bax、Bcl-2 以及Cdk-4、Cdk-6、Cyclin D1 和p21 的表达：①标准品的稀释与加样：稀释后各孔加样量都为50 μL（浓度分别为24 μg/L， 16 μg/L，8 μg/L，4 μg/L，2 μg/L）。②加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。③温育：用封板膜封板后置37 ℃温育30 分钟。④配液：将30（48T的20 倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T 的20 倍）倍稀释后备用。⑤洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 秒后弃去，如此重复5 次，拍干。⑥加酶：每孔加入酶标试剂50 μL，空白孔除外。⑦温育：操作同③。⑧洗涤：操作同⑤。⑨显色：每孔先加入显色剂A50 μL， 再加入显色剂B50 μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15 分钟。⑩终止和测定：每孔加终止液50 μL， 终止反应（此时蓝色立转黄色）。以空白孔凋零，450 nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）。 测定应在加终止液后15 分钟以内进行。

5. 流式细胞仪检测相关蛋白变化：细胞凋亡检测采用annexin V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒，用冰PBS 洗涤，再悬浮在1 个结合缓冲液中（10 mM Hepes/NaOH，pH=7.4），140 mM NaCl，2.5 mM CaCl2，在100 mL 细胞悬液中加入V-FITC 溶液 （25 mg/mL）和5 mL 溶解PI（250 mg/mL）。将细胞轻轻涡旋，室温下置于暗处孵育15 min，加入400 mL 4 ℃结合缓冲液，轻轻搅拌。为了确定细胞周期的分布，收集细胞，用冰水PBS 洗涤，在20 ℃的75%乙醇中固定过夜，1% RNase A 处理20 min 37 ℃，用50 mg/mL PI 染色，流式细胞仪检测荧光强度。

6. TOP/FOP 检测：TOPglow / FOPglow TCF 试 剂盒用于检测Wnt 信号传导途径活性，将细胞接种在6 孔板中，并根据手册用TOPglow 和FOPglow 转染，所有转染一式三份进行并重复至少3 次。

7. 实时荧光定量PCR 检测OCT4、SOX2、c-Myc 和TCF4 相关基因的表达：用TRIzol 提取总RNA，将RNA 在50 mL 无RNase 的水中洗脱并储存在-70 ℃，为了分析基因表达，根据标准方法对含有cDNA 模板，引物和SYBRGreen qPCR Master Mix 的qRT-PCR 混合物系统进行qRT-PCR，使用2-△△Ct方法计算基因表达的倍数变化。

四、统计学分析

本研究中数据全部采用SPSS20.0 统计分析软件（美国IBM 公司）进行处理；计量资料采用均数±标准差（）表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验；计数资料采用百分率（%）表示，组间比较采用χ2分析；P ＜0.05 代表差异有统计学意义。

结 果

一、TUNEL 免疫组织化学分析

与模型组相比，PPLVII 明显诱导肿瘤细胞凋亡。见图1。

图1 TUNEL 染色确定细胞凋亡水平（×100）。1A：对照组，1B：重楼皂苷VII 治疗组

二、PPLVII 影响细胞凋亡相关蛋白的表达

研究cleaved caspase-3、cleaved caspase-8、cleaved caspase-9、Bax、Bcl-2 在PPLVII 干预后CRC 细胞中表达的情况，表1 数据结果显示，PPLVII 治疗后，cleaved caspase-3、cleaved caspase-8、cleaved caspase-9 和Bax 表达增加（P 均＜0.05）；Bcl-2在PPLVII 处理后表达降低（P=0.010）。

三、PPLVII 影响细胞周期相关蛋白的表达

为了研究细胞周期变化，评估了Cdk-4、 Cdk-6、Cyclin D1 和p21 的表达，结果如表2 所示。PPLVII 处理后，Cyclin D1、Cdk-4、Cdk-6 表达下降（P 均＜0.05）；而p21 表达上调（P=0.001）。

表1 PPLVII 影响细胞凋亡相关蛋白的相对表达量（双抗体夹心法ELISA）（，ng/mL）

表1 PPLVII 影响细胞凋亡相关蛋白的相对表达量（双抗体夹心法ELISA）（，ng/mL）

组别 例数 cleaved-caspase-3 cleaved-caspase-8 cleaved-caspase-9 Bax Bcl-2对照组 10 0.75±0.02 0.53±0.04 0.39±0.01 0.26±0.02 0.29±0.04模型组 10 0.19±0.03 0.11±0.03 0.12±0.02 0.15±0.02 0.81±0.02治疗组 10 0.61±0.02 0.48±0.03 0.32±0.01 0.25±0.03 0.38±0.03 F 值 22.962 19.281 16.035 16.859 15.364 P 值 0.001 0.001 0.005 0.007 0.010

四、TOP/FOP 测定Wnt 信号通路活性

在PPLVII 干预治疗后，检测对照组细胞中TOP/FOP 比率为1.86±0.22，模型组为3.48±0.36，治疗组为2.17±0.23，三组比较差异有统计学意义（F=96.072，P ＜0.001）。

五、β-连环蛋白灰度值检测结果

通过提取细胞中的β-连环蛋白，用免疫蛋白印迹进行检测，根据图2 的结果发现与对照组相比，模型组的检测结果升高（β-连环蛋白灰度值为2.13±0.03），在PPLVII 进行干预治疗后β-连环蛋白灰度值下降为1.29±0.02（t=6.331；P=0.020）。

六、PCR 相关基因表达检测结果

在对各组检测中发现干细胞相关基因，OCT4，SOX2 和TCF4 相对于对照组，其在模型组细胞中表达上调，在PPLVII 进行干预治疗后OCT4、 SOX2、c-Myc 和TCF4 相关基因的表达下调，差异有统计学意义（P ＜0.02）。见表3。

讨 论

既往研究表明，皂苷对结直肠癌细胞具有显著的细胞毒性［11］。本次研究结果显示，从重楼中分离得到的皂苷类化合物PPLVII，通过降低Wnt 通路抑制因子的表达对CRC细胞具有生长抑制作用。考虑由于PPLVII 对DMH/DSS 诱导的CRC 模型小鼠肠道毒性和癌变有潜在的保护作用，PPLVII 细胞存活率下降部分是因诱导细胞凋亡所致，cleaved caspase-3、cleaved caspase-8、cleaved caspase-9 和Bax 蛋白水平上调，说明PPLVII 诱导的细胞凋亡与内源性凋亡通路密切相关。本次研究还发现，Bcl-2 水平在PPLVII 作用下降低，表明Bcl-2 作为Bcl-2 家族主要的抗凋亡蛋白，参与了诱导凋亡［12］。 因为从一个细胞周期向另一个细胞周期的转变是有序进行的，并通过细胞周期蛋白进行调控，不同的细胞周期蛋白在细胞周期的不同阶段达到其最大活性，细胞周期蛋白D1 在结直肠癌细胞过度表达，它与CDK4 和CDK6 结合形成CDK4/6-cyclin D1复合物是细胞进入G1 期所必需的。由于PPLVII在下调细胞周期蛋白D1、CDK4、CDK6 表达的同时，上调细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21 的表达，阻止受损DNA 复制，在CDK 抑制和G1 期阻滞中发挥重要作用。因此，PPLVII 诱导CRC 细胞G1 期阻滞是通过上调p21 表达引起的。这与Ghasemi 等［13］研究结果基本一致。

Wnt 通路在结肠肿瘤发生中起着重要作用，在60%～70%的结肠癌病例中，Wnt 信号被激活，Li 等［14］人研究表明PPLVII 不仅降低了异种移植瘤小鼠模型的肿瘤大小，而且抑制DMH/DSS 诱导的CRC 小鼠模型的肿瘤发生。Wnt 通路抑制因子是miR-590-3p 的潜在靶标， miR-590-3p 直接抑制WIF1 和DKK1 mRNA 转化为成熟蛋白，癌症特异性miRNA 对于理解肿瘤发生中的作用和探索新的治疗靶点有重要的意义。本次研究发现，PPLVII干预治疗通过降低Wnt 通路抑制因子的表达对结直肠癌有一定的改善和治疗作用。Wnt 通路抑制因子下调降低细胞球体形成，WIF1 和DKK1 在调节结肠癌细胞肿瘤发生中起重要作用［15］。WIF1 是一种脂质结合蛋白，可与Wnt 蛋白结合并阻止它们触发Wnt/β-连环蛋白途径，目前WIF1 基因在人结肠癌的外周血中被证实是失调的，并且可以做为有希望的标志物。笔者推测，WIF1 可能参与结肠癌细胞增殖和肿瘤发生，DKK1 通过与LRP 和Kremen蛋白结合阻止β-连环蛋白介导的信号转导，促进细胞分化和凋亡［16］。DKK1 在结肠癌中下调，多个分子通过下调DKK123-32 促进结直肠肿瘤发生，已经证明Wnt/β-连环蛋白信号传导参与结肠癌的发展和促进。Wnt/β-连环蛋白信号传导可被几种与Wnt 配体或降解复合物结合的因子抑制，WIF1、卷曲蛋白相关蛋白和DKK130。WIF1 和DKK1 在结肠癌组织和细胞中受miR-590-3p 的负调控，导致Wnt 信号传导的异常激活［17-18］。

表2 PPLVII 影响细胞周期相关蛋白的相对表达量（双抗体夹心法ELISA）（，ng/mL）

表2 PPLVII 影响细胞周期相关蛋白的相对表达量（双抗体夹心法ELISA）（，ng/mL）

组别 例数 Cdk-4 Cdk-6 Cyclin D1 p21对照组 10 0.31±0.04 0.19±0.01 0.15±0.03 0.47±0.02模型组 10 0.79±0.04 0.76±0.05 0.66±0.03 0.12±0.01治疗组 10 0.39±0.03 0.24±0.03 0.19±0.01 0.41±0.03 F 值 19.205 15.331 20.749 15.668 P 值 0.001 0.005 0.001 0.003

图2 蛋白印迹检测β-连环蛋白水平（WB）

表3 PCR 相关基因表达检测结果（）

表3 PCR 相关基因表达检测结果（）

组别 例数 OCT4 SOX2 c-Myc TCF4对照组 10 1.00±0.05 1.00±0.05 1.00±0.05 1.00±0.05模型组 10 2.82±0.08 2.21±0.08 3.12±0.22 3.96±0.65治疗组 10 1.34±0.02 1.36±0.02 1.15±0.01 1.11±0.01 F 值 13.762 16.375 20.236 15.766 P 值 0.010 0.016 0.014 0.011

本研究进一步证明，PPLVII 在小鼠模型中通过对WIF1 表达的影响能有效预防结肠炎相关结直肠癌的发生。笔者分析认为，WIF1 表达降低促进干细胞相关标志物的表达，例如OCT4、SOX2 和TCF4。 WIF1 和DKK1 参与Wnt /β-连环蛋白信号传导。WIF1 被抑制可以促进β-catenin 核转位，提高TOP / FOP 比率，降低β-catenin 等与MMP-9 启动子的结合，表明WIF1 在调节Wnt /β-catenin 信号通路中起重要作用，可以导致多个下游基因通过Wnt /β-连环蛋白信号转导激活；WIF1 表达降低还可以增强Cyclin D1、RUNX2 和DMP1 蛋白的表达，促进结直肠癌细胞的凋亡。