LncRNA KCNQ1OT1在肝癌组织和肝癌细胞系中表达及对肝癌干细胞自我更新能力的调节作用观察

刘志礼，宜建英，王丹丹，邓慧婷，刘树业

1 天津市第三中心医院/天津市肝胆研究所/天津市人工细胞工程技术研究中心，天津300170；2 天津市第一中心医院

肿瘤干细胞是肿瘤组织中一小群具有自我更新和无限增殖能力的细胞。大量的研究[1]显示，肿瘤干细胞在肿瘤的发生、转移、耐药，特别是在肿瘤的复发、异质性的形成等方面发挥着重要的调控作用。然而，肿瘤干细胞维持自我更新的分子调控机制尚不完全清楚。长链非编码RNA(lncRNAs)是一类基本不具备蛋白编码功能且长度大于200个核苷酸的转录本。越来越多的证据[2]表明，lncRNAs在机体内通过与转录因子结合、调控染色质重塑和竞争性吸附微小RNAs等多种方式参与了胚胎发育、器官形成、X染色质失活、肿瘤发生等重要的生理和病理学过程。KCNQ1OT1作为一种lncRNA，参与了乳腺癌、非小细胞肺癌的发生、发展。Li等[3]利用体内体外实验证明，KCNQ1OT1通过竞争性吸附microRNA-504从而促进肝癌细胞的增殖。Hu等[4]研究证实，KCNQ1OT1可以通过对miR-7-5p/ABCC1轴进行调节进而增强肝癌细胞对奥沙利铂的耐药。上述研究表明，KCNQ1OT1在肝癌细胞增殖、耐药等过程中发挥着重要的调控作用，但是KCNQ1OT1是否参与调控肝癌干细胞的自我更新仍需要进一步研究。本研究通过检测KCNQ1OT1在肝癌组织和肝癌细胞系中的表达，观察下调KCNQ1OT1表达对肝癌干细胞自我更新能力以及Hippo-YAP通路关键靶基因表达的影响，探讨KCNQ1OT1调控肝癌干细胞自我更新的机制，旨在为以KCNQ1OT1为靶点的肝癌诊疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 临床标本、肝癌细胞系及试剂 收集从2018年12月～2019年12月期间在天津市第三中心医院经组织病理检查确诊的肝癌患者20例，肝癌患者均接受肝癌切除术治疗，术中留取癌组织及癌旁组织，液氮中保存。患者均签署知情同意书，天津市第三中心医院伦理委员会批准了本研究临床样本的使用。实验中所使用的肝癌细胞系(Huh7、SMMC7721、Hep3B)、人永生化正常肝上皮细胞L02以及293T细胞均购买于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，细胞均培养在含有10%胎牛血清和1%青/链霉素的DMEM/F12培养基中，所有细胞均放置于37℃、5%CO2培养箱中进行培养。DMEM/F12培养基购自美国 Invitrogen公司，1%青/链霉素购自美国Life Technology公司，胎牛血清购自美国Gibco公司，N2和B27细胞培养添加剂购自美国Invitrogen公司，胰酶和胶原酶Ⅳ购自美国Sigam Aldrich公司，生长因子bFGF和EGF购自美国Proteintech公司，TRIzol购自美国 Invitrogen公司，反转录试剂盒和实时荧光定量PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司，CD13和CD133流式抗体购自美国Biolegend公司，通过小干扰RNA技术抑制KCNQ1OT1表达的KCNQ1OT1敲降质粒KCNQ1OT1 shRNA及其对照质粒sh-Ctrl、引物均由中国上海吉玛公司合成，细胞培养瓶、培养皿及超低吸附六孔培养板均购自美国Thermo公司。

1.2 肝癌组织与癌旁组织、肝癌细胞系与人永生化正常肝上皮细胞中KCNQ1OT1的检测 采用RT-PCR法。使用TRIzol试剂提取组织和细胞中的总RNA，然后根据试剂盒说明书对所提取的RNA进行逆转录并进行实时定量PCR(RT-PCR)扩增。引物的序列如下：KCNQ1OT1正向引物为5′-CTTTGCAGCAACCTCCTTGT-3′,反向引物为5′-TGGGGTGAGGGATCTGAA-3′；GAPDH正向引物为5′-CCAGGGCTGCTTTTAACTCT-3′,反向引物为5′-GGACTCCACGACGTACTCA3′。PCR反应参数如下：95℃预变性5 min，95℃ 15 s、60℃ 60 s，40个循环。以2-ΔΔCt表示组织或细胞中目的基因mRNA的相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.3 肝癌干细胞分选分组、KCNQ1OT1 shRNA转染及自我更新能力观察和Hippo-YAP通路靶基因mRNA检测

1.3.1 肝癌干细胞分选分组、KCNQ1OT1 shRNA转染 使用胰酶和胶原酶Ⅳ将Huh7细胞消化成单个细胞悬液，PBS洗涤2次后，重悬在500 μL FACS缓冲液中，加入5 μL CD13-PE和5 μL CD133-APC抗体，充分混匀后4℃避光孵育30 min，孵育结束后弃上清再用PBS洗涤2次，用流式分选仪筛选获得CD13+CD133+的肝癌干细胞。取对数生长期肝癌干细胞，记为A组；取对数生长期肝癌干细胞，慢病毒转染法转染KCNQ1OT1 shRNA慢病毒载体，建立KCNQ1OT1稳定敲降细胞系肝癌干细胞，以转染sh-Ctrl的肝癌干细胞为对照，采用RT-PCR法筛选KCNQ1OT1相对表达量显著降低的肝癌干细胞，记为B组；取对数生长期KCNQ1OT1稳定敲降细胞系，使用Lipofectamine 3 000脂质体转染YAP1过表达载体，采用RT-PCR法筛选YAP1 mRNA相对表达量显著升高的KCNQ1OT1稳定敲降细胞系，记为C组。

1.3.2 各组肝癌干细胞自我更新能力观察 ①各组肝癌干细胞成球能力观察。使用胰酶和胶原酶Ⅳ将各组肝癌干细胞分别消化成单个细胞悬液，分别计数5 000个细胞接种到超低吸附的6孔板中，用包含有20 ng/mL EGF、20 ng/mL bFGF、N2和B27的DMEM/F12培养基进行培养，培养基每隔一天更换一次并轻轻晃动以防止细胞贴壁，2周后观察成球情况，计算各组肝癌干细胞的成球率。②各组肝癌干细胞克隆形成能力观察。采用克隆形成实验。将各组肝癌干细胞分别消化为单个细胞悬液，计数后分别取300个细胞接种于6孔板中，培养基每3天更换1次，14天后弃去培养基，PBS冲洗两遍后，使用4%多聚甲醛固定，结晶紫染液染色15 min后，计数各组克隆形成数。③各组肝癌干细胞增殖能力观察。采用CCK8实验。将各组肝癌干细胞分别消化为单个细胞悬液，分别取100 μL接种于96孔板中,在培养24、48、72、96 h时每孔加入10 μL CCK8溶液，继续孵育3 h，用酶标仪测定各孔450 nm处的OD值。

1.3.3 各组肝癌干细胞中Hippo-YAP通路靶基因Yap1、Birc5、Foxm1 mRNA检测 采用RT-PCR法。参照方法“1.2”，检测各组肝癌干细胞中Yap1、Birc5、Foxm1 mRNA的相对表达量。引物序列如下：Yap1正向引物为5′-TAGCCCTGCGTAGCCAGTTA-3′,反向引物为5′-TCATGCTTAGTCCACTGTCTGT-3′；Birc5正向引物为5′-CCAGATGACGACCCCATAGAG-3′,反向引物为-TTGTTGGTTTCCTTTGCAATTTT-3′；Foxm1正向引物为5′-CGTCGGCCACTGATTCTCAAA-3′,反向引物为5′-GGCAGGGGATCTCTTAGGTTC-3′。以2-ΔΔCt表示细胞中目的基因mRNA的相对表达量。实验重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 肝癌组织与癌旁组织、肝癌细胞系与人永生化正常肝上皮细胞中KCNQ1OT1的相对表达量比较 肝癌组织与癌旁组织中KCNQ1OT1的相对表达量分别为4.947±0.944、1.161±0.471，两者相比，P<0.05，提示KCNQ1OT1在肝癌组织中高表达。Huh7、SMMC7721、Hep3B细胞中KCNQ1OT1的相对表达量分别为2.933±0.216、1.423±0.125、2.490±0.137，L02细胞中KCNQ1OT1的相对表达量为1.033±0.191，Huh7、SMMC7721、Hep3B细胞中KCNQ1OT1的相对表达量与L02细胞相比，P均<0.05，提示KCNQ1OT1在肝癌细胞系Huh7、SMMC7721、Hep3B中高表达。

2.2 各组自我更新能力和Hippo-YAP通路靶基因mRNA相对表达量比较

2.2.1 各组肝癌干细胞自我更新能力比较 ①各组肝癌干细胞成球能力比较。A、B、C组肝癌干细胞成球率分别为3.010%±0.003%、1.063%±0.002%、2.100%±0.002%，其中B组与A、C组相比，P均<0.05。②各组肝癌干细胞克隆形成能力比较。A、B、C组肝癌干细胞克隆形成数分别为76.667±8.505、34.667±4.803、51.333±5.686，其中B组与A、C组相比，P均<0.05。③各组肝癌干细胞增殖能力比较。A组肝癌干细胞24、48、72、96 h时的OD值分别为0.503±0.042、0.817±0.116、1.313±0.168、1.613±0.158，B组肝癌干细胞24、48、72、96 h时的OD值分别为0.385±0.051、0.545±0.095、0.785±0.150、0.965±0.140,C组肝癌干细胞24、48、72、96 h时的OD值分别为0.483±0.065、0.737±0.086、1.127±0.163、1.353±0.140，其中B组与A、C组相比，P均<0.05。

2.2.2 各组肝癌干细胞中Yap1、Birc5、Foxm1 mRNA相对表达量比较 A组肝癌干细胞中Yap1、Birc5、Foxm1 mRNA相对表达量分别为0.957±0.114、0.953±0.138、0.940±0.089，B组肝癌干细胞中Yap1、Birc5、Foxm1 mRNA相对表达量分别为0.333±0.086、0.417±0.096、0.210±0.056，C组肝癌干细胞中Yap1、Birc5、Foxm1 mRNA相对表达量分别为0.873±0.137、0.897±0.136、0.820±0.123，其中B组与A、C组相比，P均<0.05。

3 讨论

肝癌是目前临床常见的恶性肿瘤，肝癌的发病多起源于肝脏的慢性炎症，与酗酒、长期高脂饮食、接触黄曲霉毒素尤其是与感染慢性病毒性肝炎等密切相关。据世界卫生组织统计，从2000年到2016年肝癌死亡率增加了43%。我国的发病人数约占全球发病人数的55%，死亡率位居恶性肿瘤的第二位，且发病率和死亡率均呈逐年上升趋势。肝癌的异质性大且易复发，这与肝癌组织中残留的一小群具有自我更新和再次成瘤能力的肝癌干细胞密切相关。因此，深入研究肝癌干细胞自我更新的分子调控机制，寻找新型的分子靶标，以期提高临床的治疗效果，改善患者的预后水平，是当前肝癌研究领域的热点。

LncRNAs通过多个层面包括表观遗传水平、转录水平以及转录后水平对基因表达进行调控，广泛参与机体的生理和病理学过程，其在很多肿瘤的发生、转移、耐药等过程中发挥着重要的作用。如lncRNA MCM3AP-AS1通过与miR-194-5p直接结合充当竞争性内源RNAs(ceRNAs)，导致miR-194-5p的靶基因FOXA1在肝癌细胞中高表达，从而促进肝癌细胞的增殖，并抑制凋亡[5]。HOXD-AS1作为一种抑癌lncRNA，通过将PRC2募集到HOXD3的启动子区域从而抑制HOXD3的转录,使MAPK/AKT信号通路失活，进而使得结直肠癌细胞增殖和转移能力降低[6]。TINCR通过竞争性吸附miR-125b，使得miR-125b的靶基因Snail-1表达升高从而造成乳腺癌细胞对曲妥珠单抗耐药。此外，最新的一些研究发现，lncRNAs还参与肿瘤干细胞自我更新的调节。Fu等[7]报道，LncRNA HOTTIP通过与HOXA9结合间接激活Wnt信号通路，从而促进人胰腺癌干细胞的自我更新。Wang等[8]发现，HAND2-AS1通过招募INO80染色体重塑复合体到BMPR1A的启动子区域，激活了BMP信号通路，进而参与肝癌干细胞的自我更新。KCNQ1OT1是一种由RNA聚合酶Ⅱ编码、长度为91.5 kb、中等稳定的核苷酸转录本。最初发现KCNQ1OT1在贝克威思-威德曼综合征中表达异常，随后研究陆续报道KCNQ1OT1调控肝癌细胞的增殖和耐药，但KCNQ1OT1是否影响肝癌干细胞的自我更新未见报道。本研究结果显示，KCNQ1OT1在肝癌组织和肝癌细胞系中高表达，这与Li等[3]报道的KCNQ1OT1在肝癌组织中高表达相一致。进一步敲降KCNQ1OT1后发现，肝癌干细胞的成球能力、克隆形成能力和增殖能力明显降低，上述结果表明KCNQ1OT1参与肝癌干细胞的自我更新。为深入研究KCNQ1OT1促进肝癌干细胞自我更新的作用机制，我们首先通过查阅文献发现Wnt/β-catenin(靶基因Myc、Kiaa、Tiam)、NF-κB(靶基因Vegf、Mmp2、Twist1)、Hippo-YAP(靶基因Yap1、Birc5、Foxm1)、Notch(靶基因Hes1、Nrarp、Hey1)和Hedgehog(靶基因Gli3、Patched、Gli1)通路在多种肿瘤干细胞的自我更新过程中起着非常关键的作用，上述信号通路的失活能够明显的抑制肿瘤干细胞的自我更新，肿瘤的增殖及克隆形成[9]。Qu等[10]研究发现，lncARSR可以通过与YAP1结合，使YAP1去磷酸化，促进YAP1转运进入细胞核与转录因子TEADs结合，增加干性基因的表达从而参与肾癌干细胞的调节。Li等[11]研究表明，B4GALT1-AS1通过募集HuR来增强YAP1的转录活性从而促进骨肉瘤干细胞的自我更新。而在KCNQ1OT1敲降的肝癌干细胞中，Hippo-YAP通路上3个关键靶基因的表达水平相对于对照组显著降低，这提示KCNQ1OT1可能通过作用于Hippo-YAP通路促进肝癌干细胞的自我更新。随后，挽救实验证实了YAP1是KCNQ1OT1调控肝癌干细胞自我更新的作用靶点。

综上所述，KCNQ1OT1在肝癌组织和肝癌细胞系中高表达，抑制KCNQ1OT1的表达可能通过Hippo-YAP信号通路影响肝癌干细胞的自我更新能力。KCNQ1OT1有望成为肝癌临床诊疗的新型干预靶点。