大肠埃希菌中细胞分裂抑制子的潜在调控基因筛选

刘健平，鲁洋，曾建明,陈茶

1 广州中医药大学第二附属医院，广州510000；2 广东省中医院

1994年Fuque[1]首次提出群体感应系统(QS)的概念，打开了细菌间通信机制研究的大门，QS系统已成为微生物领域的研究热点。QS概念描述了细菌通过感知特定信号分子浓度以监测环境中群体密度的变化，继而进行细菌间特定的交流，当信号分子达到一定浓度阈值时，诱导菌体相关基因的表达来适应环境中的变化。在革兰氏阴性菌中，细菌通过自身合成并分泌特定的信号分子N-酰基-L-高丝氨酸内酯(AHLs)与相应的受体蛋白结合后形成复合物，在特定的基因启动子序列处结合DNA，然后激活或抑制靶基因转录。大肠埃希菌(E.coli)自身不合成AHLs，但含有AHLs受体细胞分裂抑制子(Sdi A)蛋白，可感应并应答其他细菌产生的群体信号分子。Sdi A蛋白最初仅被认为是细胞分裂抑制因子，可抑制细胞分裂，后来发现Sdi A蛋白是大肠埃希菌惟一明确的QS系统受体蛋白，具有转录调节功能，可调控自身多项生命活动[2]。目前研究[3～5]发现，大肠埃希菌群体感应系统可介导细菌的耐酸性、毒力、运动性、生物膜形成、耐药性等多种生理过程。随着新一代测序技术的发展和测序平台建立的日趋完善，转录组测序可快速可靠地获得物种在某一状态下几乎全部转录本及基因序列，再通过生物信息学工具抓取足够的信息来对特定物种进行分析，以推测其调控规律[6]。本研究为继续寻找Sdi A蛋白调控细菌生命活动的可能机制，通过联合E.coliSM10λpir野生株、E.coliSM10λpir Sdi A敲除株、E.coliSM10λpir Sdi A过表达回复株经过有或无AHLs信号分子处理后收集菌液进行测序，通过生物信息学方法分析各菌株基因表达的差异情况，综合分析Sdi A的潜在调控基因，为后续进一步揭示Sdi A蛋白的生物学功能及其调控生命活动的具体机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌株及试剂 菌株E.coliSM10λpir野生株、E.coliSM10λpir Sdi A敲除株、E.coliSM10λpir Sdi A过表达回复株由本实验室保存，3-oxo-C12-HSL购自Sigma公司，C4-HSL购自Cayman公司，RNA提取试剂盒购自东盛公司。

1.2 菌株分组及处理 取E.coliSM10λpir野生株、E.coliSM10λpir Sdi A敲除株、E.coliSM10λpir Sdi A过表达回复株过夜菌液100 μL，分别接种到2支含3 mL新鲜LB液体培养基玻璃试管中，分别记为非AHLs处理组和AHLs处理组。AHLs处理组中加入AHLs信号分子3-oxo-C12-HSL与C4-HSL的混合液，使其终浓度为20 μmol/L；非AHLs处理组加入等量DMSO。

1.3 差异表达基因的筛选方法 三种菌株经37℃ 220 r/min震荡培养4 h后收集菌液，用RNA抽提试剂盒提取细菌总RNA，置于-80℃保存，送广州瑞科基因科技有限公司进行基因转录组测序。转录组测序的原始数据经trinity RNA-Seq(https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq)处理，然后通过R语言edgeR软件包筛选差异表达基因，筛选条件：︱log2FC︱>1.5且P<0.05。

1.4 Sdi A潜在调控基因的筛选 ①无AHLs信号分子时Sdi A的潜在调控基因筛选。选取非AHLs处理组组内E.coliSM10λpir Sdi A敲除株与E.coliSM10λpir野生株之间、E.coliSM10λpir Sdi A过表达回复株与E.coliSM10λpir Sdi A敲除株之间同时出现差异性表达的基因，即为无AHLs信号分子时Sdi A的潜在调控基因。②有AHLs信号分子时Sdi A的潜在调控基因筛选。选取AHLs处理组组内E.coliSM10λpir Sdi A敲除株与E.coliSM10λpir野生株之间、E.coliSM10λpir Sdi A过表达回复株与E.coliSM10λpir Sdi A敲除株之间同时出现差异性表达的基因，即为有AHLs信号分子时Sdi A的潜在调控基因。③两组Sdi A潜在调控基因比对。比对无AHLs信号分子时Sdi A的潜在调控基因、有AHLs信号分子时Sdi A的潜在调控基因，观察有、无AHLs信号分子时Sdi A潜在调控基因的变化。

2 结果

2.1 无AHLs信号分子时Sdi A潜在调控基因的筛选结果 非AHLs处理组中，与E.coliSM10λpir野生株相比，E.coliSM10λpir Sdi A敲除株有14个基因出现差异性表达，其中8个基因表达上调，包括narH、narJ、narI、yeeE、cysW、iraD、yfaP、narG基因，6个基因表达下调，包括mhpE、paaE、yiaN、yeeS、yeeR、flu基因；与E.coliSM10λpir Sdi A敲除株比较，E.coliSM10λpir Sdi A过表达回复株有108个基因出现差异性表达，其中64个基因表达上调，包括nanC、nanM、nanS、yjhB、lacY、ssnA、flu、ygeW、nanT、dmlA、nanE、lacZ、ygfK、nanA、mglA、nanK、dctA、hycF、hdhA、sdhC、ygeY、ygeX、dsdX、yjhC、ygfM、hyaB、mglB、hycE、ydcI、hycG、cstA、xdhA、flgA、galS、dadA、yhcH、xdhD、hyaF、hyaA、uacT、sdhA、msrB、xdhB、xdhC、allC、allD、paaE、emrY、yjfN、sgrS、glpF、ydeN、melA、yeeR、hycH、yjiY、tdcB、glsA、uspC、fadH、hyaD、dsdA、hycD、hyuA基因，44个基因表达下调，包括nikD、endA、opgC、yjbI、nikR、sodA、yfcC、narK、guaB、aqpZ、nikC、nirB、yqeI、pyrD、nrfD、ybjE、nikA、yccM、nrfC、nrfE、yqeJ、wcaL、phoE、narH、hmp、rzpR、nrfF、mntP、nikB、narJ、ptsG、wcaG、dhaM、ycaK、ygbA、yhjX、narI、dhaL、hsdS、dhaK、ytfE、yeeE、hcr、hcp基因。由上可知，E.coliSM10λpir Sdi A敲除株与E.coliSM10λpir野生株之间、E.coliSM10λpir Sdi A过表达回复株与E.coliSM10λpir Sdi A敲除株之间同时出现差异性表达的基因为narH、narJ、narI、yeeE、yeeR、paaE、flu。其中，Sdi A基因敲除时，narH、narJ、narI、yeeE基因表达上调，yeeR、paaE、flu基因表达下调；而在Sdi A回复过表达后，上述基因表达趋势相反，即narH、narJ、narI、yeeE基因表达下调，yeeR、paaE、flu基因表达上调，提示无AHLs信号分子时上述基因受到Sdi A的潜在调控。

2.2 有AHLs信号分子时Sdi A潜在调控基因的筛选结果 AHLs处理组中，与E.coliSM10λpir野生株相比，E.coliSM10λpir Sdi A敲除株有18个基因出现差异性表达，其中13个基因表达上调，包括hcp、ytfE、hcr、narI、fimI、fimF、fimC、narH、narJ、narG、fimD、hmp、fimA基因，5个基因表达下调，包括ydiV、gadW、hdhA、yeeR、flu；与E.coliSM10λpir Sdi A敲除株比较，E.coliSM10λpir Sdi A过表达回复株有91个基因出现差异性表达，其中55个基因表达上调，包括nanC、nanM、nanS、yjhB、lacY、flu、nanT、lacZ、nanE、hdhA、nanA、gadW、yhcH、dmlA、nanK、uacT、sdhC、mglB、ygeW、yjhC、ydiV、ygfK、sdhD、dadA、mglA、dctA、xylF、ssnA、ygeY、cstA、yciE、ygeX、ygfT、acrE、dgoA、sdhA、msrB、sdhB、yeeR、eutT、ynaJ、ybiA、mglC、ybcL、fliM、xdhA、allD、yjfJ、dsdX、xdhD、ygfM、fliF、hofN、galS、gltJ基因，36个基因表达下调，包括phoE、hypA、rpmE、nikB、mntP、purL、cvpA、ydiY、nikC、xanP、nrfD、nrfA、nrfC、narK、nrfG、ptsG、nrfB、purE、nikA、ygbA、nrfE、yccM、narH、wcaG、nrfF、narI、narJ、nirB、dhaL、hsdS、hmp、dhaK、dhaM、hcr、ytfE、hcp基因。由上可知，E.coliSM10λpir Sdi A敲除株与E.coliSM10λpir野生株之间、E.coliSM10λpir Sdi A过表达回复株与E.coliSM10λpir Sdi A敲除株之间同时出现差异性表达的基因为hcp、ytfE、hcr、hmp、narH、narJ、narI、yeeE、yeeR、flu、ydiV、hdhA。其中，Sdi A基因敲除时，hcp、ytfE、hcr、hmp、narH、narJ、narI、yeeE基因表达上调，yeeR、flu、ydiV、hdhA基因表达下调；而在Sdi A回复过表达后，上述基因表达趋势相反，即hcp、ytfE、hcr、hmp、narH、narJ、narI、yeeE基因表达下调，yeeR、flu、ydiV、hdhA基因表达上调，提示有AHLs信号分子时上述基因受到Sdi A的潜在调控。

2.3 两组菌株中Sdi A潜在调控基因比对结果 narH、narJ、narI、yeeE、yeeR、flu基因在两组菌株中均为Sdi A的潜在调控基因，hcp、ytfE、hcr、hmp、ydiV、hdhA基因仅在AHLs信号分子存在时为Sdi A的潜在调控基因。

3 讨论

Sdi A作为重要的转录因子和大肠埃希菌中目前惟一明确的QS系统受体蛋白，参与细菌的多项生命活动，受到研究人员的强烈关注[7]。然而，尽管有关Sdi A的研究报道众多，但由于研究模型和研究方法的差异，得到的结论不尽相同。近年来，随着测序手段的成熟和各式分析工具的应用，从测序结果中抓取重要的生物信息已被认为十分可信，在微生物种群鉴定领域中已广泛应用。本研究通过敲除及过表达回复E.coliSM10λpir的Sdi A基因，在有或无AHLs信号分子时，利用RNA-seq测序技术获得样本转录组信息，筛选其中差异表达基因进行分析，使得我们获取的信息具有全面性，又保证了结果的可靠性。通过比对AHLs处理组与非AHLs处理组中Sdi A潜在调控基因发现，无论是否有AHLs信号分子存在，narH、narJ、narI、yeeE、yeeR、flu基因的表达均受到Sdi A基因的调控，提示Sdi A潜在调控上述基因，且此调控不依赖AHLs信号分子。此外，hcp、ytfE、hcr、hmp、ydiV、hdhA基因仅在AHLs信号分子存在时出现表达变化，提示Sdi A对这几个基因的调控依赖于AHLs信号分子的存在。

在大肠埃希菌中，narH、narG、narJ、narI基因编码的硝酸还原酶复合体NarGHI是一种异三聚体复合铁硫[Fe-S]钼酸酶，包括含催化亚基的钼辅因子(NarG)、含电子转移亚基的[Fe-S]簇(NarH)和含血红素的膜锚亚基(NarI)，它可在周质的Q-位点氧化萘醌或泛醌，在细胞质的钼辅因子(双钼酸盐鸟嘌呤二核苷酸，Mo-bisMGD)中还原硝酸盐[8]。目前NarGHI复合体的研究报道甚少，其具体机制仍处于摸索阶段。有报道[9]称，NarGHI复合体可受环境因素的影响，但具体机制尚未明确。而作为QS系统的受体分子，Sdi A亦与环境因素密切相关，因此，NarGHI复合体受到Sdi A的调控不无道理。结合本研究测序结果，NarGHI复合体家族基因均受Sdi A的潜在调控，是Sdi A参与细菌硝酸盐代谢有力证据。鉴于目前未有Sdi A参与调控NarGHI复合体或调控硝酸盐代谢相关的研究报道，因此，进一步深入研究二者的调控关系意义重大。另一方面，当加入AHLs后，另一与硝酸盐还原有关的基因hcp、hcr亦受到明显影响，进一步说明Sdi A与硝酸盐代谢有密切关系。hcp、hcr基因受同一个操纵子调控，hcp编码一种高亲和力一氧化氮(NO)还原酶，是厌氧条件下将NO变成N2O的主要酶，hcr编码一种NADH依赖的还原酶。研究[10]显示，hcr保护hcp不被NO灭活，两者联合表达，保护多种细菌免受亚硝酸盐的胁迫。hcp缺失将会导致细菌生长期间对NO极为敏感。研究[11]显示，在厌氧环境中膜相关硝酸还原酶NarG表达上升，细菌还原亚硝酸盐生成副产物NO增多，细菌为保护自身免受NO胁迫，上调表达hcp、hcr基因。大肠埃希菌黄血球蛋白(Hmp)是目前已知的NO解毒蛋白，具有很强的双加氧酶活性，以氧为底物将NO转化为硝酸根离子。通过转录调节hmp基因表达合成Hmp是对NO及相关硝态氮胁迫的一种适应性反应，因此hmp是大肠埃希菌一种重要的保护机制，并且可能有助于肠致病性大肠埃希菌在肠道炎症反应期间的存活时间[12]。hcp与hmp同为硝酸盐代谢相关基因，两者存在一定的协同关系。近期研究[13]显示，ytfE编码YtfE蛋白，可作为铁供体，参与修复被氧化和亚硝化条件破坏的含铁硫酶活性所必需的蛋白质，该基因的表达在AHLs的刺激下受到Sdi A的调控，可能与上述硝酸还原酶复合体NarGHI的表达变化有关。综上所述，在本次测序结果中，NarGHI复合体基因、hcp、hcr、hmp、ytfE基因均受到Sdi A的潜在调控，多个靶基因指向Sdi A参与细菌硝酸盐的代谢，在Sdi A缺失时，上述基因表达增强，提示Sdi A可能抑制上述基因的表达。人类体内大肠埃希菌天然定植于肠道中，在这一厌氧环境下，大肠埃希菌可能通过调节Sdi A的表达量继而调控自身硝酸盐代谢，但具体机制还需进一步研究。

flu基因又名为Ag43基因，编码Ag43蛋白，是大肠埃希菌中一种重要的外膜自转运体黏附蛋白。该蛋白受体不仅存在于人类靶细胞上，而且存在于细菌的表面，导致细菌相互黏附，并通过细菌自身聚集形成微菌落[14]。flu基因的缺失会干扰生物膜的形成[15]，其表达受到甲基化酶脱氧腺苷-DNA-甲基转移酶(Dam)和氧化应激调节子OxyR的调控，OxyR作为flu基因表达的阻遏子，与Dam竞争结合flu启动子区域实现flu的抑制或表达[16]。研究[17,18]推断环境信号可能影响Dam与OxyR的竞争结果，但目前具体的环境因素或调节子尚未明确。近期研究报道，Sdi A也是影响大肠埃希菌生物膜形成的重要分子，但flu是否介导Sdi A调控生物膜形成的研究尚未见报道，且Sdi A在调控flu表达过程中是否与Dam、OxyR具有协同或拮抗作用同样有待进一步探讨。另一方面，yeeR、yeeE基因为同一个家族成员，是细胞膜的组成部分，yeeR与flu由同一个操纵子操控，在本次测序结果中共同受Sdi A的正向调控，而yeeE则呈反向调控，提示上述基因表达改变可能是影响细菌生物膜形成的又一因素。

大肠埃希菌中，ydiV基因编码抗FLhD4C2因子，该因子在鞭毛基因表达水平上充当营养条件的调节剂。研究[19]表明，在低营养条件下，通过多重质粒过表达ydiV时，会减少鞭毛的产生和抑制大肠埃希菌的运动性。ydiV基因在加入AHLs信号分子后出现差异性表达，正符合Sdi A通过感知环境调节自身基因表达的模式。虽然QS系统调控鞭毛的合成早有报道，但ydiV基因受QS系统调控却是由本研究首次提出。

paaE基因编码PaaE，是苯乙酰加单氧化酶A复合体(PA-CoA)的部分亚基。PaaE亚单位是一种选择性NADPH和FAD的还原酶，其双铁中心可直接进行电子转移，还原细胞色素C，催化芳香环的氧化[20]。大肠埃希菌利用PA-CoA复合体来代谢苯乙酸(PA)。PA是一种环境污染物，大肠埃希菌可代谢PA进而获得碳源。根据测序结果，paaE的表达量与Sdi A的表达量呈正相关，可能是细菌感知环境PA聚积后作出的一系列反应。

hdhA基因编码7α-羟基甾体脱氢酶，其底物主要是酒精、葡萄糖、15-羟基前列腺素和羟类固醇等[21]。大肠埃希菌中，该酶可转化胆汁，继而获得能量，但由于其研究甚少，具体的功能尚未被详细报道。有研究[22]指出，在有氧条件下，环境渗透胁迫可诱导hdhA基因在转录水平上的表达增高。Sdi A作为环境的感受器，同时是转录调节子，在AHLs信号分子刺激下，参与hdhA基因的调控不无道理。

综上所述，大肠埃希菌中Sdi A的潜在调控基因有narH、narJ、narI、yeeE、yeeR、flu、paaE、hcp、ytfE、hcr、hmp、ydiV、hdhA，其中对hcp、ytfE、hcr、hmp、ydiV、hdhA基因的调控依赖于AHLs信号分子，为下一步揭示Sdi A新的生物学功能打下了坚实的基础。