武夷岩茶香气相关酶基因表达差异分析

武广珩，谢其婷，吕橄，林志銮,，王飞权，任宇红，张传海*

(1 福建省生态产业绿色技术重点实验室，福建 武夷山 354300；2 武夷学院生态与资源工程学院，福建 武夷山 354300；3 中国乌龙茶产业协同创新中心，福建 武夷山 354300；4 华东理工大学生物工程学院/生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237)

我国的饮茶历史很长，产于福建省北部、武夷山地区的武夷岩茶，香高馥郁、滋味醇厚滑润，属于半发酵的青茶，是闽北乌龙茶的代表、中国十大名茶之一，也是乌龙茶的始祖[1]。武夷岩茶亦是所有茶类中工序最多、最复杂的茶类，一般制作工序为：采摘、萎凋、做青(发酵)、杀青、揉捻、烘干、挑拣、毛茶、初焙(走水)、退火、复焙、成茶(精茶)[2]。水仙和肉桂是武夷岩茶产区中的2个主要品种[3]。肉桂茶的香气犹如桂皮，茶汤色彩橙黄清澈，回甘醇厚浓郁；水仙茶汤有淡淡的花果香味，颜色比较清澈透亮[4]。瑞香属于中生高香品种，是从黄旦杂交后代中选育而来，茶汤香气馥郁高扬，花果香较母本更为显著，最大的特色是滋味不苦不涩且甘润醇厚[5-6]。

茶叶的加工过程中，影响茶叶香气的几种重要酶类有：β-葡萄糖苷酶(beta-glucosidase，BG)、β-樱草糖苷酶(beta-primroseglucosidase，BP)、多酚氧化酶(Polyphenol oxidase，PPO)、抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbate peroxidase，APX)。邓慧莉等[7]发现大多数香气的前体是以β-葡萄糖苷的形式而存在的，而β-葡萄糖苷酶促使这些香气前体的释放。陈寿松等[8]发现β-樱草糖苷酶和β-葡萄糖苷酶的基因相对表达量与香气前体物质的物质总量及糖苷类成分的变化成正相关性。多酚氧化酶是决定茶叶品质的重要酶类之一，它不仅影响茶树的生理代谢，也影响着制作成茶的过程中多酚类物质的氧化程度，红茶中的茶红素和茶黄素是通过多酚氧化酶的酶促作用形成[9]。抗坏血酸过氧化物酶是植物活性氧代谢中重要的抗氧化酶之一，又是维生素C代谢的主要酶类，在福鼎大白茶在萎凋的过程中，APX基因的表达量随着萎凋时间的延长呈现出“升高—降低—再升高—再降低”的变化特点[10]。

影响茶叶品质的内因有茶叶品种本身的内含物、加工过程中的酶活性变化和酶基因的表达差异等；外因有温度、湿度、光照、土壤、茶叶的采制技术等。本论文通过研究武夷岩茶主打品种肉桂、水仙、瑞香鲜叶香气相关酶基因的表达差异，对影响茶品质内因方面展开探讨，为加工品质更优的茶叶提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

2018年4月20日—5月15日，武夷学院茶树种质资源圃的肉桂、水仙、瑞香新鲜嫩芽叶片。采摘标准：一芽二叶，采样后用液氮预冷处理。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及cDNA第一链的合成

采用Eastep Super总RNA提取试剂盒(Promega)提取肉桂、水仙、瑞香新鲜嫩芽叶片总RNA，用微量核酸检测仪(Eppendorf BioPhotometer Plus)检测RNA样品质量和浓度，并用1%琼脂糖凝胶电泳检测其清晰度与完整性，保存于-80 ℃冰箱(SANYO MDF-682)备用。采用GoScriptTMReverse Transcription Mix(Promega)逆转录试剂盒将已经提取的总RNA反转录成cDNA。具体使用步骤见说明书。

1.2.2 基因克隆及序列分析

根据NCBI已登录的过氧化物酶和多酚氧化酶序列(登录号：JQ740734.1和AY659975.1)，分别设计过氧化物酶基因(CsAPX)和多酚氧化酶基因(CsPPO)的引物(表1)。PCR反应采用25 μL体系：TaKaRa Ex Taq PCR反应体系；反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s；按52 ℃退火40 s；72 ℃延伸1 min，35个循环，72 ℃延伸10 min；产物4 ℃保存。所有的PCR产物均用1%凝胶电泳，然后将目标片段的PCR产物按照UNIQ-10柱式微量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(上海生工)回收目的基因条带，并委托上海生工进行序列测定。

表1 用于克隆茶树过氧化物酶和多酚氧化酶基因cDNA片段的引物序列Tab.1 Primer cDNA pairs for amplifying polyphenol oxidase and peroxidase genes

1.2.3 荧光定量PCR分析

使用实时定量PCR仪(Bio-rad Connect 96)进行扩增，SYBR Green试剂盒为SuperReal PreMix Plus(TIANGEN)，反应程序为:95 ℃预变性90 s，95 ℃变性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，40个循环。以茶树18S rRNA为内参，根据1.2.2得到的香气相关酶CsAPX和CsPPO基因序列设计引物和已经报道的CsBG1、CsBP及18S rRNA基因引物序列进行表达量分析[11]，见表2。

表2 用于实时定量PCR的引物序列Tab.2 Primer sequences of Real-time PCR

1.2.4 数据分析

通过GenBank数据库进行序列检索比对。基因的相对表达量，使用Excel 2007和One-way ANOVO对数据进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 茶叶总RNA的提取

用肉桂、水仙、瑞香3个样品的新鲜叶片提取总RNA，经1%的琼脂糖凝胶快速电泳检测。从图1中可知，3个样品肉桂、水仙、瑞香总RNA电泳图谱带型清晰、条带完整，有3个条带，提取结果较为理想。经RNA浓度测定后反转录为cDNA，用于后续实验。

2.2 CsAPX和CsPPO基因的扩增

为了扩增武夷岩茶中过氧化物酶和多酚氧化酶的目的基因，选取其中的水仙、肉桂和瑞香的cDNA为模板，进行了基因片段的PCR扩增，并获得对应的条带(图2)。PCR所需引物(表1)根据NCBI已登录的过氧化物酶和多酚氧化酶序列(登录号：JQ740734.1和AY659975.1)设计。测序发现，3个品种的CsAPX基因编码431个氨基酸，CsPPO基因编码575个氨基酸；CDS序列间仅存在个别的SNP差异。

M—DL2000 DNA标记；1—瑞香；2—水仙；3—肉桂。图1 茶树总RNA的电泳图Fig.1 Total RNA extraction of tea plant

A—CsAPX PCR扩增；B—CsPPO PCR扩增；M—DNA标记；1—水仙；2—肉桂；3—瑞香。图2 克隆茶树过氧化物酶和多酚氧化酶基因片段Fig.2 PCR amplification of polyphenol oxidase and peroxidase gene from tea plant

2.3 实时荧光定量分析

为了明确实验中4对基因实时定量PCR引物的可靠性，以水仙的cDNA作为模板进行了PCR检测。从图3可看出，第2～5泳道4条明亮程度和大小不一的扩增条带。之后，以肉桂、水仙、瑞香3个样品的cDNA为模板，以表2中的序列为引物，进行qPCR。结果表明，品种水仙和瑞香的鲜叶中CsPPO基因的表达量很低，肉桂中的表达量比18S rRNA低，但显著高于水仙和瑞香(图4 A)；肉桂鲜叶中几乎不表达CsBP基因，但水仙与瑞香中均有表达，且水仙中的表达量要明显多于瑞香(图4B)；肉桂、水仙、瑞香中都有CsBG1的表达，但瑞香中的表达最多，水仙次之，肉桂最少(图4C)；CsAPX在3个茶叶品种中也都有表达，且肉桂和水仙中的表达量相当，瑞香较少(图4D)。

M—DL2000 DNA标记；1—rt-Cs18S；2—rt-CsAPX；3—rt-CsBG1；4—rt-CsBP；5—rt-CsPPO。图3 茶树中基因表达引物的检测Fig.3 Detection of primers for gene expression in tea plants

不同的字母代表显著性差异(P<0.01，one way ANOVA)。图4 不同茶树鲜叶中香气相关酶的基因表达模式分析Fig.4 Real-time analysis of expression levels of aroma related genes

3 结论与讨论

研究[12]表明，在绿茶的加工过程中，由于多酚氧化酶的活力略有上升，使得儿茶素被氧化，减轻了儿茶素的苦涩味；儿茶素氧化过程中产生的邻醌与蛋白质分解后的氨基酸作用后形成甜香味。本研究中，肉桂鲜叶中CsPPO的表达量明显高于水仙和瑞香，所以肉桂冲泡的茶汤会比水仙和瑞香的茶汤更加浓郁，回甘更加醇厚。

β-樱草糖苷酶对于茶叶而言，其主要作用是通过水解萜醇类糖苷香气前体，使茶叶呈现出天然花香[7]。CsBP在水仙鲜叶中的表达量比瑞香更多，但二者都显著高于肉桂，故水仙冲泡的茶汤中天然花香最为浓郁，瑞香次之。

在茶叶的加工过程中，β-葡萄糖苷酶可以促进糖苷类香气前体的水解并释放出挥发性糖苷，为茶叶香气成分的积累提供物质基础，从而可增加茶叶的香气[13]。结果显示肉桂、水仙、瑞香中都有CsBG的表达，但瑞香中的含量最多，故而瑞香茶汤的茶香味更浓。

抗坏血酸过氧化物酶(APX)在红茶加工中，可以将某些黄烷醇类物质经过氧化作用形成茶黄素，而茶黄素又能迅速经氧化聚合作用形成复杂的茶红素类物质，茶红素在成品茶的褐色方面起到了重要的作用[14]。CsAPX基因的表达在3个品种中都有存在，且肉桂和水仙中的表达量相当，但瑞香中的含量相比之下较少。因此，在茶汤色泽方面，相同的焙火条件，肉桂和水仙的颜色较瑞香会更深；同时由于肉桂鲜叶中CsPPO的表达量明显高于水仙，所以在CsAPX和CsPPO基因的双重作用下，肉桂茶汤最深，水仙次之。

综上所述，本研究的结论与人们日常在冲泡相同加工工艺、相同品牌的肉桂、水仙、瑞香所产生的认知一致，为今后选择茶叶鲜叶用于后期加工提供了理论支持。