大蒜醇提液对小鼠离体小肠平滑肌运动的影响

阿迪莱·艾力，赵树林，李璐璐，孙小燕，余万里，郝智慧，赵红琼

(新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐 830052)

0 引 言

【研究意义】大蒜(Garlic)为百合科植物大蒜(AlliumsativumL.)的磷茎，是药食两用的植物，已有数千年的应用历史[1]。《本草纲目》记载：“捣汁饮治吐血心痛”，具有行滞气、暖脾胃、消淤积之功效[2]。《中华人民共和国兽药典》记录大蒜性味辛温，归脾、胃、肺经，具有理气开胃，解毒等功效，主治慢草不食，肚腹胀满，虫积腹痛，下痢[3]。研究大蒜醇提液对胃肠运动的影响，对了解其可能的作用机制有实际意义。【前人研究进展】大蒜的药用价值主要是通过其有效成分大蒜素起作用[4，5]，大蒜素由100多种硫化物组成，呈白色粉末状，有浓重的蒜臭味，不溶于水、甘油等，能溶于酒精、氯仿等有机溶剂[6]。大蒜素能改善动物体内蛋白质代谢和氨基酸平衡，提高动物对蛋白质的利用率继而提高动物的生产性能[7]。王建平[8]报道，注射大蒜素可促进小鼠胃动素的分泌、胃排空和肠推进。大蒜素灌胃3 h后可使蓖麻油腹泻模型小鼠排稀便次数减少[9]。【本研究切入点】大蒜及其有效成分具有理气开胃和治疗腹胀等功效，其对消化道动力影响研究较少。目前研究初步发现大蒜素对胃肠动力有影响，但其对胃肠收缩幅度和收缩频率的影响及其机制尚不清楚。研究大蒜醇提液对小鼠离体小肠平滑肌运动的影响。【拟解决的关键问题】研究大蒜主要成分对消化道运动的影响，用生物信号处理系统监测大蒜醇提液对小鼠离体小肠平滑肌运动的影响，了解其对胃肠动力的局部影响及其可能的作用机制，为开发大蒜及其有效成分在胃肠动力方面的药用价值提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 动物

昆明小鼠，12只，雌雄各半，体重(27 ± 5)g，购于新疆医科大学实验动物中心。

1.1.2 药材和试剂

外皮干燥的大蒜鳞茎2019年1月购于新疆乌鲁木齐市某菜市场；氯钡胆碱(Bethanechol chloride，BCh)为M-胆碱受体激动剂，分子量196.68，Sigma-Aldrich，USA生产，批号：MKBQ9916V；氯化钾(Potassium chloride，KCl)，分子量74.55，sigma-aldrich生产，批号：WXBC0510V；台氏营养液配方见参考文献[10]，现配现用。

1.1.3 仪器设备

生物信号处理系统Power lab 8/30(ML870)，桥式放大器(ML118)，配套记录软件为Chart 5，均为澳大利亚ADInstruments公司产品；张力换能器(MLT0201/RAD)，量程5 mg～25 g，西班牙Panlab公司产品；超声波清洗器(WD9415E型)，北京六一生物科技有限公司。加热电功率：500W±30%、超声功率：40KHz±30%。

1.2 方 法

1.2.1 大蒜醇提液的制备

将大蒜鳞茎剥去外皮后，切除基部须根痕，剩余鳞茎瓣用小型杯状粉碎机打成葱泥。将蒜泥(为大蒜鳞茎重量65.4%)转入锥形瓶内，以1∶2的体积比浸泡在95%乙醇中，封口后放入-4℃冰箱过夜，然后放入超声清洗器50℃水浴，超声提取(50%功率)1 h。超声提取物先用棉布袋粗过滤，再用滤纸抽滤，保存滤液；将过滤残渣再次用同量95%乙醇浸泡后超声提取(条件同上)，过滤，反复2次。合并3次滤液，用真空旋转蒸发仪浓缩至蒜泥重量的20%(在试验中定义为100%原液)，-20℃保存，备用，当日开始试验。

1.2.2 大蒜醇提液对小鼠离体小肠运动影响

大蒜醇提液对小鼠离体肠运动的影响试验，小鼠离体小肠运动描记方法以及参数设置见文献[11]。离体小肠负重1 g，待小肠段运动稳定后记录小肠正常收缩曲线，作为用药前对照。为了找到药物剂量-反应关系，大蒜醇提液加入台氏营养液时采取2倍浓度递增的方法(0.025%、0.05%、0.1%、0.2%和0.4%)，即一次加入一定量大蒜醇提液原液后，不换营养液，直接再加入一定量大蒜醇提液原液，每次加药间隔为3 min，最后用台氏营养液冲洗3次，每次间隔1 min[12]，观察清洗后其运动是否恢复到用药前。统计指标包括：收缩张力，以各次收缩之间的最低点表示，在Chart 5软件中用“周期平均最小值”计算；收缩幅度，每次收缩的高度，在Chart 5软件中用“平均周期幅值”计算。

1.2.3 大蒜醇提液抑制小肠运动机制

通过浓度递增试验得到大蒜醇提液抑制小鼠离体小肠运动最大有效浓度为0.2%。探究大蒜醇提液抑制肠运动是否同阻断胆碱能M-受体有关，以及对KCl引起小肠收缩的影响，试验将大蒜醇提液与M-受体激动剂BCh[13]或KCl[14]联合用药，试验分为5个处理：大蒜醇提液单独用药3 min，BCh单独用药3 min，大蒜醇提液用药1 min后加入BCh 2 min联合用药，KCl单独用药3 min，大蒜醇提液用药1 min后加入KCl 2 min联合用药；大蒜醇提液、 BCh和KCl用药浓度分别为0.2%、3 × 10-5mol/L和5 × 10-2mol/L。统计指标包括：收缩张力、收缩幅度、峰值和用药后曲线下面积(在chart 5软件中用“最小值以上积分”计算BCh或KCl用药后2 min内曲线下面积)。

1.3 数据处理

所有统计指标均换算成用药前的百分比，用平均值 ± 标准误(SEM)表示。用SPSS 16.0 软件进行单因素方差分析，P< 0.05表示差异显著，P< 0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 浓度递增的大蒜醇提液对小鼠离体小肠运动的影响

研究表明,浓度递增的大蒜醇提液剂量依赖性抑制小鼠离体小肠平滑肌的运动，浓度达到0.2%时小肠运动完全抑制，但经过3次清洗后，小肠平滑肌运动恢复。随着大蒜醇提液浓度递增小肠收缩张力同用药前比较差异不显著(P> 0.05)。当大蒜醇提液浓度递增到0.05%和0.1%时，小肠收缩幅度同用药前比较差异显著(P< 0.05)，分别为用药前的94% ± 9%和70% ± 10%；当大蒜醇提液浓度递增到0.2%和0.4%时，小肠收缩幅度同用药前比较差异极显著(P< 0.01)，分别为用药前的21% ± 4%和19% ± 3%。图1

A. 描记曲线，大蒜醇提液使用浓度为0.025%、0.05%、0.1%、0.2%和0.4%；B. 收缩张力统计结果；C. 收缩幅度统计结果；所有值为其用药前的百分比，用平均值 ± 标准误表示，与用药前比较差异显著用*表示(P< 0.05)，差异极显著用**表示(P< 0.01)

A.Tracing curve, extract from garlic used at the dose of 0.025%、0.05%、0.1%、0.2% and 0.4%; B. Statistical results of contraction tension; C. Statistical results of contraction amplitude; All values are the percentage of pre-administration, expressed as mean±SEM;*indicated significantly different from pre-administration (P< 0.05), and**indicated extremely significantly different from pre-administration (P< 0.01)

图1 浓度递增的大蒜醇提液下小鼠小肠平滑肌运动变化
Fig. 1 Effects of alcohol extract from garlic followed by the concentration increasing on the motility of murine small intestine

A.描记曲线，B.统计结果；所有值为其用药前的百分比，用平均值 ± 标准误表示；与用药前比较差异显著用*表示(P< 0.05)，差异极显著用**表示(P< 0.0.1)

A. Tracing curve; B. Statistical results; All values are the percentage of pre-administration, expressed as mean ± SEM;*indicated significantly different from pre-administration (P< 0.05), and**indicated extremely significantly different from pre-administration (P< 0.01)

图2 0.2%大蒜醇提液下小鼠小肠平滑肌运动变化
Fig. 2 Effect of 0.2% alcohol extract from garlic on the motility of murine small intestine

A. 3 × 10-5mol/L氯贝胆碱单独用药描记曲线；B. 0.2%大蒜醇提液和3 × 10-5mol/L氯贝胆碱联合用药描记曲线；C. 统计结果，用平均值 ± 标准误表示，单独用药与联合用药比较差异显著用*表示(P< 0.05)，差异极显著用**表示(P< 0.01)

A.Tracing curve added 3 × 10-5mol/L BCh alone; B. Tracing curve combined 0.2% alcohol extract from garlic and 3 × 10-5mol/L BCh; C. Statistical results, expressed as mean ± SEM;*indicated significantly different between KCl alone and garlic combined with KCl (P< 0.05), and**indicated extremely significantly different (P< 0.01)

图3 大蒜醇提液与M-受体激动剂联合用药下小鼠小肠运动变化
Fig. 3 Effect of alcohol extract from garlic combined with BCh on the motility of murine small intestine

2.2 0.2%大蒜醇提液对对小鼠离体小肠运动的影响

研究表明,大蒜醇提液抑制小鼠离体小肠运动的最有效浓度为0.2%，往台氏营养液里一次性加入0.2%大蒜醇提液对小鼠离体小肠运动的影响。加入0.2%大蒜醇提液后离体小肠收缩幅度明显减小。0.2%大蒜醇提液用药后，小肠收缩张力同用药前比较差异不显著(P> 0.05)；而收缩幅度同用药前比较差异极显著(P< 0.01)，为用药前26% ± 7%。图2

2.3 大蒜醇提液与M-受体激动剂联合用药对小鼠小肠运动的影响

研究表明,大蒜醇提液与M-受体激动剂BCh联合用药对小鼠小肠运动的影响。3 × 10-5mol/L BCh单独用药后小肠运动迅速出现峰值，为用药前174% ± 26%；0.2%大蒜醇提液用药1 min内小肠收缩幅度明显减小，再加入 3 × 10-5mol/L BCh小肠运动迅速出现峰值，为用药前151%±7%。大蒜醇提液与BCh联合用药同BCh单独用药比较收缩张力、收缩幅度、峰值和曲线下面积均差异不显著(P> 0.05)。图3

2.4 大蒜醇提液与KCl联合用药对小鼠小肠运动的影响

研究表明,大蒜醇提液与氯化钾联合用药对小鼠小肠运动的影响。5 × 10-2mol/L KCl单独用药后小肠运动迅速出现峰值，为用药前199% ± 16%，并迅速回落，但收缩张力依然高于用药前；0.2%大蒜醇提液与5 × 10-2mol/L KCl联合用药小肠运动迅速出现峰值，为用药前260% ± 67%。大蒜醇提液与KCl联合用药同KCl单独用药比较收缩张力、收缩幅度、峰值和曲线下面积均差异不显著(P> 0.05)。图4

3 讨 论

试验用生物信号处理系统研究显示，大蒜醇提液剂量依赖性减小小鼠离体小肠平滑肌收缩幅度，但对收缩张力无影响，提示大蒜醇提液对小鼠离体胃肠运动具有抑制作用。王建平[8]研究显示腹腔注射大蒜素可升高血清胃动素和生长激素释放肽(ghrelin)水平以及促进胃排空和肠推进作用。马晓莉等[15]也报道，大蒜硝黄膏穴位贴敷可增强小鼠胃排空、肠蠕动和促进排便。以上两个研究结果与此次试验研究结果相反，一方面，可能是因为那两个研究均使用大蒜的主要成分大蒜素，而研究使用的是大蒜醇提液，可能在成分上的差异造成其对胃肠动力作用的相反。其次，那两个研究做的是在体试验，而此次试验是离体试验。在体胃肠运动受到神经-体液的调节，用药后对其影响机制较复杂，而离体试验胃肠平滑肌离开机体后不受机体整体调节，调控机制相对简单，因而大蒜用药后对胃肠运动影响在体和离体可能存在差异。

A. 5 × 10-2mol/L氯化钾单独用药描记曲线；B. 0.2%大蒜醇提液和 5 × 10-2mol/L氯化钾联合用药描记曲线；C-统计结果，用平均值 ± 标准误表示，单独用药与联合用药比较差异显著用*表示(P< 0.05)，差异极显著用**表示(P< 0.0.1)

A. Tracing curve of 5 × 10-2mol/L KCl alone; B. Tracing curve of 0.2% alcohol extract from garlic combined with 5 × 10-2mol/L KCl; C. Statistical results, expressed as mean±SEM ;*indicated significantly different between BCh alone and garlic combined with BCh (P < 0.05), and**indicated extremely significantly different (P< 0.01)

图4 大蒜醇提液与氯化钾联合用药下小鼠小肠运动变化
Fig. 4 Effect of alcohol extract from garlic combined with KCl on the motility of murine small intestine

胃肠平滑肌上胆碱能M-受体兴奋通过第二信使三磷酸肌醇(IP3)引起肌浆网钙释放，而使胞浆内钙离子浓度增加。试验结果显示，一次性使用0.2%大蒜醇提液使小肠收缩幅度较用药前降低26% ± 7%，而其对M-受体特异性激动剂BCh引起的小肠收缩无影响，提示大蒜醇提液对小肠收缩的抑制作用可能同抑制M-受体无关。

小肠平滑肌细胞水平的生物电有静息电位、慢波电位和动作电位[16]。小肠平滑肌细胞兴奋的标志是在慢波电位基础上动作电位的产生。Cajal间质细胞为特殊分化的神经细胞，位于消化道肌间神经丛和黏膜下层之间，是胃肠活动的起搏器和传导细胞，能够产生慢波电位并将其传导[17]。细胞外高钾时，静息电位水平较低，有助于Cajal间质细胞产生的慢波电位接近阈电位，爆发动作电位，使平滑肌兴奋。试验用 5 × 10-2mol/L KCl单独用药后小肠运动迅速出现峰值，为用药前199% ± 16%，而大蒜醇提液对 KCl引起的小肠快速收缩无影响，提示其对小肠收缩运动的抑制作用可能与阻止细胞内钾离子外流减少(即阈值减小)无关。

4 结 论

大蒜醇提液剂量依赖性抑制小鼠离体小肠平滑肌的运动，大蒜醇提液抑制小肠收缩幅度的最效浓度为0.2%，小肠收缩幅度仅为用药前26% ± 7%(P< 0.01)；0.2%大蒜醇提液与M-受体激动剂氯贝胆碱或 KCl联合用药对小肠收缩张力、收缩幅度、峰值和曲线下面积与这两种药物单独用药比差异均不显著，大蒜醇提液对小肠运动的抑制作用可能同抑制胆碱能 M-受体和阻止细胞内钾离子外流减少无关。